核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素对慢性乙型肝炎大鼠法尼醇X受体-成纤维细胞生长因子19通路、枯否细胞极化的影响*

颜成果 闪海霞 吴玉卓 卢瑞杰 温 泉

（南阳市中心医院感染性疾病科，南阳 473000）

慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B，CHB）存在肠道屏障功能异常的情况，久而久之就会导致胆汁酸淤积，而这也是肝损伤的主要诱因。此外，乙型肝炎病毒感染也会导致慢性炎症，促进肝损伤及肝纤维化的发生、发展。因此，如何改善肠道屏障功能、遏制胆汁酸淤积，抑制炎症反应是目前临床关注的焦点之一[1-3]。法尼醇X受体（farnesol X receptor，FXR）是一种高度表达于肠、肝组织的核受体，可与靶基因成纤维细胞生长因子19（fibroblast growth factor 19，FGF19）相互作用抑制胆汁酸的合成，抑制炎症反应，从而对肝损伤具有一定保护作用，故FXR-FGF19通路将有望成为慢性乙型肝炎的新型治疗靶点[4]。枯否细胞是一种特殊非实质肝巨噬细胞，可通过分泌炎症因子在肝纤维化中发挥重要的调控作用，因此枯否细胞已经成为肝纤维化防治研究的一个关键靶点[5]。目前，临床对于慢性乙型肝炎治疗在抗病毒方面有单药和联合治疗2种方案，抗病毒药物主要为核苷（酸）类似物和聚乙二醇干扰素，这2种药物单药治疗均有各自的局限，因此研究人员将2种药物进行联合应用，以探索最佳的治疗方案[6]。目前大量研究已经证实，核苷（酸）类似物和聚乙二醇干扰素联合应用效果比单药更佳，但其作用机制尚未明确。因此，本研究就其联合用药对慢性乙型肝炎大鼠FXR-FGF19通路、枯否细胞极化的影响进行探讨，以期为临床治疗提供理论基础[7]。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组

本实验选取南京金莱畅生物科技有限公司提供的60只SPF级SD雄性大鼠[合格证书为：SCXK（苏）2019-0015]，体质量210～270 g，室温生长，单笼喂养，模仿12 h昼夜交替，在常温下进行无菌自由进食、饮水2周，按照《实验动物管理条例》规定进行实验。随机选取建模成功的大鼠40只，将其随机分为模型组、核苷（酸）类似物（核苷酸）组、聚乙二醇干扰素（干扰素）组、联合组，每组10只，取剩余10只健康大鼠作为正常组。对核苷酸组灌胃10 mg/kg的拉米夫定（货号：H20103481，湖南千金湘江药业股份有限公司），对干扰素组皮下注射5 μg/kg的聚乙二醇干扰素（上海罗氏制药有限公司），对联合组灌胃10 mg/kg的拉米夫定后皮下注射5 μg/kg的聚乙二醇干扰素，3组均1次/天，治疗28 d。正常组、模型组同期灌胃同体积生理盐水。

1.2 乙型肝炎建模

随机选取50只大鼠，固定好后腹腔注射10 mL/kg的1×106/mL的乙肝病毒（上海酶联有限公司），每周1次，连续4周，然后检测大鼠血清中天冬氨酸氨基转移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基转移酶（alanine aminotransferase，ALT）、乙型肝炎表面抗原（hepatitis B surface antigen，HBsAg）、乙型肝炎E抗原（hepatitis B E antigen，HBeAg），若其水平明显上升，则视为建模成功。造模过程中大鼠无死亡，建模失败3只，其余均建模成功。

1.3 标本采集

实验完成后，腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉处死大鼠，从眼球后静脉丛取血，离心、取上清液置于冰箱中密封保存，同时取肝组织固定48 h后，用生理盐水漂洗干净，放入冰箱中密封保存。

1.4 ELISA法检测血清病毒相关指标

取各组大鼠血清，酶联免疫吸附试剂盒（深圳市健竹有限公司）检测HBsAg、HBeAg水平，实验步骤严格按试剂盒说明书进行，实验完成后，立即用酶标仪在波长450 nm处，测定每孔吸光度，计算血清中HBsAg、HBeAg含量。

1.5 全自动生化分析仪检测血清肝功能指标

取各组大鼠血清，采用全自动血清生化仪（上海玉研有限公司）检测大鼠血清中 ALT、AST、总胆红素（total bilirubin，TBIL）水平，实验步骤严格按照仪器说明书进行。

1.6 H-E染色观察肝组织

取各组肝组织，梯度乙醇依次脱水，二甲苯透明后将其浸于软蜡中60 min，石蜡包埋40 min，切片后经60℃烤箱烤片2 h，二甲苯脱蜡2次，梯度乙醇洗脱后，苏木素染色，流水冲洗，盐酸乙醇分色10 s，伊红染色1 min，染色完成后除去多余染液，进行梯度乙醇脱水、二甲苯透明和中性树胶封片处理，光学显微镜下进行组织病理学观察。

1.7 免疫印迹检测FXR-FGF19通路蛋白表达

取各组肝组织，加入200 μL RAPI裂解液（西安赫特有限公司）后用组织匀浆机进行充分匀浆，然后离心取上清液，用 BCA法测定蛋白样品含量，加入1×PBS和Simple Loading Buffer混匀，将其置于 95℃干式恒温器中加热 5 min，冷却后进行SDS-PAGE电泳，电泳完成后用半干电转移法恒流转膜1 h，然后5%脱脂牛奶封闭1 h，PBS洗涤，加入稀释的FXR、FGF19一抗（均为1∶1 000），4℃过夜孵育，PBS洗涤后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，滴加显色液显色，在暗室中进行电化学发光、曝光、X射线胶片显影后用Quantity One软件进行灰度值分析，以同一样本中GAPDH为内参，计算比值求得FXR、FGF19蛋白表达量。

1.8 免疫组织化学显色检测枯否细胞极化相关指标

取各组肝组织，进行常规石蜡包埋、切片、脱蜡、水化后，PBS洗涤，加入3%过氧化氢孵育10 min，加入pH 6.0的枸橼酸钠抗原修复液高压热修复5 min，冷却后PBS洗涤，加入非特异性血清孵育30 min，PBS洗涤，加入稀释的iNOS、CD163一抗（1∶500），4℃过夜孵育，PBS洗涤，加入生物素标记的二抗（1∶2 000），37℃孵育20 min，PBS洗涤，链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶，室温孵育10 min，DAB显色3 min，PBS洗涤，进行苏木精复染、脱水、透明、封片、显微镜下观察，用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统计算阳性细胞个数及其均值，阳性细胞呈棕黄色。

1.9 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0对各组大鼠FXRFGF19通路、枯否细胞极化相关指标进行统计分析，数据符合正态分布采用±s表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清病毒相关指标

与正常组相比，模型组血清HBsAg、HBeAg含量显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，核苷酸组、干扰素组、联合组血清HBsAg、HBeAg含量显著降低（P＜0.05），核苷酸组、干扰素组对比差异无统计学意义（P＞0.05），联合组比干扰素组显著降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠血清HBsAg、HBeAg水平（n=10，±s）

表1 各组大鼠血清HBsAg、HBeAg水平（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常组；#P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs干扰素组

组别HBsAg（IU/mL）HBeAg（IU/mL）正常组1.33±0.22 8.67±1.06模型组4.33±0.74*50.88±3.12*核苷酸组3.25±0.68*#40.44±2.01*#干扰素组3.37±0.71*#40.60±2.03*#联合组2.59±0.31*#△24.32±1.86*#△

2.2 各组大鼠血清肝功能相关指标

与正常组相比，模型组血清ALT、AST、TBIL水平显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，核苷酸组、干扰素组、联合组血清ALT、AST、TBIL水平显著降低（P＜0.05），核苷酸组、干扰素组对比差异无统计学意义（P＞0.05），联合组比干扰素组显著降低（P＜0.05）（表2）。

表2 各组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平（n=10，±s）

表2 各组大鼠血清中ALT、AST、TBIL水平（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常组；#P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs干扰素组

组别ALT（U/L） AST（U/L）TBIL（μmoL/L）正常组 50.66±2.89155.85±6.26 3.69±0.88模型组540.26±8.59*630.94±12.58*15.25±2.02*核苷酸组329.51±6.77*#595.66±8.74*#13.47±1.79*#干扰素组336.55±6.78*#586.47±8.71*#13.55±1.81*#联合组280.39±4.54*#△396.44±7.01*#△10.28±1.06*#△

2.3 各组肝组织形态

各组H-E染色结果显示，正常组肝组织结构正常，肝小叶完整，肝细胞排列整齐、有序，未见明显炎症细胞浸润；模型组肝小叶结构遭到破坏，肝细胞排列紊乱并出现空泡化，可见大量细胞坏死，肝窦扩张，出现大量炎症细胞及纤维化细胞浸润。与模型组比较，核苷酸组、干扰素组、联合组病理结构明显改善，炎症细胞及坏死细胞明减少（图1）。

图1 各组大鼠肺组织H-E染色，标尺=25 μm。A：正常组；B：模型组；C：核苷酸组；D：干扰素组；E：联合组.

2.4 各组大鼠肝组织FXR-FGF19通路蛋白表达结果

与正常组相比，模型组大鼠肝组织FXR、FGF19蛋白表达显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，核苷酸组、干扰素组、联合组大鼠肝组织FXR、FGF19蛋白升高，核苷酸组、干扰素组对比差异无统计学意义（P＞0.05），联合组比干扰素组显著升高（P＜0.05）（图2）。

图2 各组大鼠肝组织FXR、FGF19蛋白表达电泳图及相对表达量。*P＜0.05 vs正常组；#P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs干扰素组.

2.5 各组大鼠血清肿瘤标志物

与正常组相比，模型组肝组织iNOS、CD163阳性表达率显著升高（P＜0.05）；与模型组相比，核苷酸组肝组织iNOS阳性表达率显著降低（P＜0.05），CD163阳性表达率显著升高（P＜0.05）；与核苷酸组相比，干扰素组肝组织iNOS、CD163阳性表达率差异无统计学意义（P＞0.05）；与干扰素组相比，联合组肝组织iNOS阳性表达率显著降低（P＜0.05），CD163阳性表达率显著升高（P＜0.05）（表3，图3）。

图3 各组大鼠肝组织iNOS（A1～E1）、CD163（A2～E2）的表达（箭头所指为阳性细胞），免疫组织化学显色，标尺=20 μm。A：正常组；B：模型组；C：核苷酸组；D：干扰素组；E：联合组.

表3 各组大鼠肝组织iNOS、CD163阳性表达率（n=10，±s，%）

表3 各组大鼠肝组织iNOS、CD163阳性表达率（n=10，±s，%）

*P＜0.05 vs正常组；#P＜0.05 vs模型组；△P＜0.05 vs干扰素组

组别iNOS（%）CD163（%）正常组10.66±1.53 9.85±1.46模型组35.88±1.89*30.94±1.68*核苷酸组29.33±1.77*#45.66±1.76*#干扰素组29.56±1.81*#45.98±1.79*#联合组20.79±1.64*#△56.25±2.01*#△

3 讨论

慢性乙型肝炎是一个全球性严重公共卫生问题，探寻一种有效的治疗手段势在必行[8-9]。故就核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素对慢性乙型肝炎大鼠FXR-FGF19通路、枯否细胞极化的影响进行研究探讨，为联合治疗提供理论基础。

近年来研究发现，聚乙二醇干扰素与拉米夫定等核苷（酸）类似物互补，故诸多学者对二者进行了联合治疗的研究，且取得了喜人的成果，因此核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素治疗慢性乙型肝炎越来越受到医学领域的关注及重视[10-12]。本研究结果显示，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素可有效减轻乙型肝炎病毒感染，并改善大鼠肝功能。分析原因可能是，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素在清除病毒的同时，保证机体免疫功能不受影响，从而抑制机体免疫炎症反应，改善肝组织炎症和坏死，进而抑制成纤维细胞活化、增殖，抑制细胞外基质的沉积，最终有效改善肝组织炎症损伤及肝纤维化。何卫美等研究表明[13]，对于乙型肝炎感染大鼠，拉米夫定联合苦参碱可显著降低血清ALT、AST、TBIL水平，降低乙型肝炎感染引起的肝损伤，这与本文结果类似。

近年研究发现，FXR-FGF19通路可能在肝炎症、损伤、纤维化中发挥重要的调控作用，因此该通路目前已经成为临床研究的重点之一[14-15]。本研究结果表明，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素可显著激活FXR-FGF19通路。分析原因可能是，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素通过调控相关信号，来激活FXR，从而促进FXR与FGF19结合，激活FXR-FGF19通路，进而调控下游靶基因的转录及表达，抑制肝细胞的凋亡、拮抗促纤维化细胞因子表达等，最终有效改善肝损伤及纤维化。夏恩蕊等研究发现[16]，在非酒精性脂肪性肝炎大鼠中FXR-FGF19通路蛋白呈低表达，给予治疗后FXRFGF19通路被激活，疾病症状得到显著改善，这与本研究结果类似。

研究发现，巨噬细胞可通过极化参与肝纤维化的调控，而枯否细胞是体内最大的巨噬细胞群，其M1/M2表型失衡是慢性乙型肝炎等慢性炎症性疾病发病机制的关键环节[17-19]。本研究结果显示，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素可抑制枯否细胞M1极化，促进枯否细胞M2极化。分析原因可能是，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素通过抑制免疫炎症反应，来抑制枯否细胞聚集、浸润，从而抑制其向M1型极化，促进M2极化，进而抑制炎症细胞募集，抑制促炎症细胞因子的分泌，促进抑炎因子的分泌等，最终达到抑制肝纤维化的形成，改善疾病症状的目的。苏思标研究发现[20]，抑制枯否细胞M1极化，促进枯否细胞M2极化，维持M1/M2的极化平衡，可显著减少促炎症因子的产生，抑制肝纤维化的发生、发展，这与本文结果类似。

综上所述，核苷（酸）类似物联合聚乙二醇干扰素可显著激活FXR-FGF19通路，并抑制枯否细胞M1极化，促进枯否细胞M2极化，对慢性乙型肝炎大鼠具有改善作用。