不同吸氧浓度对慢性阻塞性肺疾病大鼠环加氧酶2/前列腺素/E-前列腺素类激素信号通路及上皮细胞活性的作用机制*

郑立风 张 露 赵红霞 李芳圆 梁金排

（1 衡水市人民医院呼吸与危重症科，衡水 053000；2 深州市医院呼吸与危重症科，深州 053000）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）的主要特征为持续性气流受限且呈进行性发展[1-2]。由于目前治疗COPD的药物疗效并不十分理想，因此探究有效治疗COPD的方法是目前临床亟需解决的难题。研究表明[3]，氧气的吸入可确保COPD患者重要脏器的氧气供应，但高浓度的氧气吸入会通过在肺部的气体交换而造成肺部损伤。但目前关于不同吸氧浓度对COPD大鼠的作用机制未见报道。COPD的发病机制复杂，相关文献报道气道炎症是导致COPD的主要机制，COPD的发病率和死亡率会随着炎症加重而增加[4]。环加氧酶2（cyclooxygenase-2，COX-2）是近年来研究较广泛的炎症相关分子之一，其表达会随着炎症信号刺激而增加[5-6]。前列腺素E2（prostaglandin E2，PEG2）作为一种炎症介质可结合E-前列腺素类激素（E-prostanoid，EP）受体，进而启动下游多种信号转导途径[7]。有研究显示[8]，COX-2/PEG2信号通路可促进烟雾暴露导致的气道炎症，但目前关于不同吸氧浓度对COPD大鼠模型中COX-2/PEG2/EP信号通路的变化尚不清楚。因此，本研究旨在探究不同吸氧浓度对COPD大鼠COX-2/PEG2/EP信号通路及上皮细胞活性的影响。

1 材料和方法

1.1 实验动物

50只6～8周龄健康雄性SD大鼠均购自山东省动物实验中心，合格证号：SCXK2019-0003。大鼠体质量200～220 g，SPF级。将大鼠饲养在统一的动物房内，温度恒定20℃～24℃，相对湿度为40%～60%，光照12 h一循环昼夜交替，适应性喂养大鼠1周。实验过程中遵循“3R”原则。

1.2 试剂和仪器

白细胞介素（interleukin，IL）6（IL-6）、IL-8、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA试剂盒（武汉基因美科技有限公司）；PGE2 ELISA试剂盒（中国联科生物公司）；COX-2抗体、EP1抗体、EP4抗体、GAPDH抗体（美国Abcam公司）；人支气管上皮细胞BEAS-2B（上海雅吉生物科技有限公司）；有机玻璃吸氧舱、烟熏箱自制；黄果树香烟（贵州中烟工业公司）；电热恒温箱（厦门鹭基有限公司）；小动物肺功能仪（上海玉研科学仪器有限公司）。

1.3 模型制备和分组

将实验大鼠随机分为正常对照组、COPD组、50% O2组、70% O2组、90% O2组，每组10只。本研究根据参考文献[9]制备COPD大鼠模型。除正常对照组外，其余各组大鼠均置于动物烟熏箱中，恒定烟熏箱中烟雾浓度为450～500 bpm，烟熏时间每次30 min，3 h烟熏1次，烟盒12 h更换1次；同时经烟熏大鼠气管内滴注脂多糖，每次0.2 mg/kg，连续干预12周。通过检测大鼠肺功能指标判定COPD模型是否成功。

造模成功后，将5组大鼠均置于自制的有机玻璃吸氧舱内，并控制氧气流量调节舱内氧气浓度，正常对照组和COPD组大鼠吸入氧浓度（FiO2）为21%，50% O2组、70% O2组、90% O2组大鼠FiO2分别为50%、70%、90%，吸氧时间均为40 min[10]。

1.4 肺功能检测

氧疗干预结束后，各组大鼠均经腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，消毒颈部皮肤并沿正中位切开，将肌肉组织钝性分离暴露气管，插入连接有三通开关的气管插管并结扎，将大鼠仰卧位置于密闭体积描计器内，和肺功能仪相结合，进行机械通气。分别记录各组大鼠吸气阻力（RI）、肺总量（TLC）、用力肺活量（FVC）、50 ms用力呼气量（FEV50）。

1.5 肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）的采集

肺功能检测结束后，继续向下剪开各组大鼠颈部皮肤，打开胸腔并充分暴露肺组织，结扎右主支气管，将灌胃针插入到左支气管中1 cm并将末端结扎，经灌胃针注入4℃生理盐水5 mL于左肺，30 s后抽出左肺中3～4 mL的生理盐水后再注入，重复3次，最后一次抽取液体并置于离心管中。在4℃环境中以3 000 r/min的速度离心液体20 min，收集上清液，用ELISA法检测BALF中PGE2、IL-6、IL-8、TNF-α水平。将离心管中的细胞沉淀在光学显微镜下进行细胞分类计数，分别统计各组巨噬细胞、中性粒细胞和淋巴细胞的百分比。

1.6 肺组织病理学变化检测

采集BALF后分离各组大鼠右肺上叶，用4%多聚甲醛溶液固定肺组织，48 h后取出肺组织用石蜡包埋，用切片机将肺组织切成厚度为5 μm的组织薄片，用苏木精-伊红（H-E）染色肺组织，显微镜下观察肺组织病理学变化。

1.7 免疫印迹检测肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达

取各小鼠50 mg肺组织，于冰上裂解组织至组织匀浆，离心组织匀浆，用DAB法检测上清液中蛋白浓度。分别配置浓缩和分离胶，浓度分别为5%和8%，在胶孔中分别加入样品蛋白，电泳10 min后转膜。孵育2 h后，将5%封闭液加入到样品中，激活后转移到PVDF膜上，封闭PVDF膜1 h。分别加入一抗COX-2、EP1、EP4过夜，继续加入HRP标记的二抗，继续孵育2 h。用ECL检测细胞PVDF膜并成像。

1.8 香烟烟雾提取物（CSE）制备

取30 mL的RPMI-1640培养液，点燃10根黄果树香烟后和培养液共同培养，过滤所得悬浮液为CSE溶液，用RPMI-1640稀释CSE溶液浓度为2.5%，于-80℃的冰箱中保存。

1.9 BEAS-2B细胞培养和处理

将BEAS-2B培养于RPMI-1640培养基中，加入10%胎牛血清，后于37℃、5% CO2的培养箱进行贴壁培养，每隔2～3 d更换1次培养液。当细胞融合生长达到80%～90%时，取处于对数期的细胞进行后续实验。将BEAS-2B细胞分为对照组（将BEAS-2B细胞培养于正常培养基中，置于常规培养箱中培养）、CSE组（将BEAS-2B细胞培养于含2.5% CSE溶液的培养基中，置于常规培养箱中培养）、50%组（将BEAS-2B细胞培养于含2.5% CSE溶液的培养基中，置于含50% O2的培养箱中培养）、70%组（将BEAS-2B细胞培养于含2.5% CSE溶液的培养基中，置于含70% O2的培养箱中培养）、90%组（将BEAS-2B细胞培养于含2.5% CSE溶液的培养基中，置于含90% O2的培养箱中培养），各组细胞均培养48 h后进行后续实验。

1.10 CCK-8法检测细胞增殖活力

取各组BEAS-2B细胞，离心并消化细胞成为细胞悬液，稀释细胞浓度为2×105个/mL，接种细胞于96孔板内，每孔100 μL，待细胞贴壁生长。培养48 h后弃掉培养液，在孔板内加入CCK-8溶液100 μL，继续培养细胞2 h，将上清液弃掉，在酶标仪450 nm处测定各孔的吸光度值（A）。

1.11 流式细胞术检测细胞凋亡

取各组BEAS-2B细胞并消化，接种细胞于6孔板中，当细胞贴壁生长后，更换孔板的培养基。培养48 h后常规消化细胞，离心5 min，弃上清液，用PBS洗涤细胞，将提前预冷的70%乙醇加入到细胞中，在4℃环境下固定细胞，12 h后再次离心细胞5 min，后再次用PBS洗涤细胞，将含有0.01%的RNase PI染液加入到细胞中，在避光的环境中染色细胞30 min，用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.12 统计学处理

实验数据采用Graphpad Priam 8.0软件进行统计学分析。计量资料均用±s表示。不同组间数据采用单因素方差分析，两组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠肺功能比较

与正常对照组相比，COPD组大鼠肺功能指标TLC、RI均明显增加，FEV50/FVC比值明显降低（P＜0.05）；与COPD组相比，50% O2组和70% O2组大鼠肺功能指标TLC、RI均明显降低，FEV50/FVC比值明显升高，且70% O2组肺功能指标变化最显著（P＜0.05）；与COPD组相比，90% O2组大鼠肺功能指标TLC、RI均明显增加，FEV50/FVC比值明显降低（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠肺功能指标TLC、RI及FEV50/FVC比值比较（n=10，±s）

*P＜0.05 vs正常对照组 ；△P＜0.05 vs COPD组；#P＜0.05 vs 50% O2组

组别TLC（mL）RI（cmH2O·s/mL）FEV50/FVC正常对照组18.62±0.870.11±0.0149.21±1.05 COPD组25.41±1.26*0.18±0.02*35.46±0.82*50%O2组23.47±1.03*△0.15±0.02*△40.17±0.91*△70%O2组20.15±0.92*△#0.13±0.01*△#45.39±0.98*△#90%O2组29.84±1.31*△0.26±0.02*△38.92±0.93*△

2.2 各组大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平比较

与正常对照组相比，COPD组大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平均明显升高（P＜0.05）；与COPD组相比，50% O2组和70% O2组大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平均明显降低，且70% O2组降低最显著（P＜0.05）；与COPD组相比，90% O2组大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平明显升高（P＜0.05）（图1）。

图1 各组大鼠BALF中IL-6、IL-8、TNF-α、PGE2水平比较。A：IL-6水平比较；B：IL-8水平比较；C：TNF-α水平比较；E：PGE2水平比较。*P＜0.05 vs 正常对照组；△P＜0.05 vs COPD组；#P＜0.05 vs 50% O2组.

2.3 各组大鼠BALF中白细胞总数和炎症细胞比例比较

COPD组大鼠BALF中白细胞总数及单核-巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞比例明显高于正常对照组（P＜0.05）；50% O2组和70% O2组大鼠BALF中白细胞总数及单核-巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞比例均明显低于COPD组，且70% O2组变化最显著（P＜0.05）；90% O2组大鼠BALF中白细胞总数及单核-巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞比例均明显高于COPD组（P＜0.05）（表2）。

表2 各组大鼠BALF中白细胞总数、单核-巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞比例比较（n=10，±s）

表2 各组大鼠BALF中白细胞总数、单核-巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞比例比较（n=10，±s）

*P＜0.05 vs 正常对照组；△P＜0.05 vs COPD组；#P＜0.05 vs 50% O2组

组别白细胞总数/（108/L）单核-巨噬细胞（%）淋巴细胞（%）中性粒细胞（%）正常对照组1.35±0.2465.41±2.16 8.11±1.4210.46±2.31 COPD组6.18±0.51*86.25±4.07*16.45±3.56*25.47±4.09*50%O2组4.27±0.42*△81.53±3.62*△13.28±3.11*△19.34±3.26*△70%O2组3.06±0.34*△#72.61±2.82*△#10.31±2.52*△#13.41±2.68*△#90%O2组8.45±0.53*△ 90.14±4.25*△19.26±3.81*△29.65±3.11*△

2.4 各组大鼠肺组织病理学变化比较

与正常对照组相比，COPD组大鼠肺组织损伤明显，肺泡间隔增厚，且间隔损坏严重，在支气管有大量的粘液腺增生，且大量炎症细胞浸润到肺间质，明显可见肺泡萎缩，管腔变窄，符合COPD的病理学变化；与COPD组相比，50% O2组和70% O2组大鼠肺泡间隔均区域正常，萎缩肺泡及气管壁粘液腺增生得到明显改善，炎症细胞浸润明显减少，70% O2组大鼠肺组织病理学改善最显著；与COPD组相比，90% O2组大鼠肺组织明显损伤，与COPD组相似（图2）。

图2 各组大鼠肺组织H-E染色，×200，标尺=50 μm。A：正常对照组；B：COPD组；C：50% O2组；D：70% O2组；E：90% O2组.

2.5 各组大鼠肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达

COPD组大鼠肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达均明显高于正常对照组（P＜0.05）；与COPD组相比，50% O2组和70% O2组大鼠肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达均明显降低（P＜0.05）；90% O2组大鼠肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达均明显高于COPD组（P＜0.05）（图3）。

2.6 各组BEAS-2B细胞活力和凋亡比较

CSE组BEAS-2B细胞活力明显低于对照组，细胞凋亡率高于对照组（P＜0.05）；与CSE组相比，50%组和70%组BEAS-2B细胞活力均明显增加，细胞凋亡率明显降低（P＜0.05）；与CSE组相比，90%组BEAS-2B细胞活力明显降低，细胞凋亡率明显增加（P＜0.05）（图4）。

3 讨论

近年研究发现[11-13]，一定浓度的氧疗对COPD疾病可发挥治疗作用。氧疗可通过提高吸入气体中氧的浓度而增加机体的氧分压及氧含量，有效降低无氧代谢和乳酸生成，有效缓解患者肺动脉高压，同时能使急性加重期的患者达到较为满意的氧合水平[14]。目前临床上认为，吸入氧浓度为50%以上时为高浓度氧疗，当患者进行长时间的高浓度氧疗时可导致患者出现多种不良反应，包括呼吸抑制、吸收性肺不张、氧中毒等。因此众多学者提出，在给予COPD患者进行氧疗时应控制吸氧的浓度，避免以上情况发生。但目前关于COPD患者氧疗浓度的控制上尚未见相关报道。

目前临床上通常使COPD患者先吸入支气管扩张剂后，再对患者的肺功能指标进行检测，当发现FEV1/FVC＜0.7时则说明患者存在持续性气流受限，即确诊为COPD。本研究结果显示，COPD组大鼠肺功能参数TLC及RI参数明显上升，呼气流速指标FEV50/FVC比值显著降低，提示COPD大鼠模型制备成功。50% O2组和70% O2组大鼠FEV50/FVC比值明显高于COPD组，但90% O2组大鼠FEV50/FVC比值明显低于50% O2组，提示50%和70%浓度的氧疗可明显改善COPD大鼠气流受限，但90%浓度的氧疗可明显加重COPD大鼠的气流受限。Schmidt等[15]研究证实，高浓度的吸氧（FiO2＞90%）可引起肺组织损伤。

研究表明[16]，炎症反应可涉及慢阻肺患者整个肺及全身，且局部较重的炎症反应可升高IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等炎症因子水平，通过破坏肺组织结构和功能而影响肺通气和换气，进而降低肺功能并加重疾病进程。相关文献显示[17]，IL-6、IL-8可通过诱导巨噬细胞、中性粒细胞聚集、淋巴细胞黏附而释放炎症介质，激活氧化应激反应，通过损伤肺实质和肺血管而加重COPD的气道炎症反应。本研究结果显示，50% O2组和70% O2组大鼠BALF中炎症细胞浸润明显低于COPD组，但90% O2组大鼠BALF中炎症细胞浸润明显高于COPD组，提示50%和70%浓度的氧疗可改善COPD大鼠炎症水平，但90%浓度的氧疗可明显加重COPD大鼠炎症水平并加重肺损伤。朱张求等[18]研究证实，可通过下调COPD大鼠肺部炎症浸润而改善大鼠肺部炎症，减轻COPD疾病进展。

Santini等[19]通过检测COPD患者呼出气冷凝物显示，PGE2含量明显高于正常对照组，且随着PGE2含量增高导致COPD病情加重，导致FEV1/FVC值降低。相关研究表明[20]，COX-2、EP4 可显著降低炎症中PGE2的含量，因此提示COX-2-EP4信号转导途径可能通过PGE2介导多种组织损伤。本研究结果显示，50% O2组和70% O2组大鼠BALF中PGE2含量明显降低，肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达也明显减少，90% O2组PGE2含量和肺组织中COX-2、EP1、EP4蛋白表达明显高于COPD组，提示50%和70%浓度的氧疗可抑制COX-2/PEG2/EP信号通路的激活，从而抑制气道炎症反应的发生，但90%浓度的氧疗可促进COX-2/PEG2/EP信号通路的激活。李德富等[21]研究发现，MVE诱导大鼠COPD气道上皮细胞中COX-2/PEG2/EP信号通路成员明显增加，同时伴随NF-κB信号通路的活化。

为证实50%和70%浓度的氧疗对COPD大鼠的改善作用，本研究通过体外实验研究BEAS-2B细胞活性和凋亡率。结果显示CSE组细胞活力明显降低，凋亡率明显增加，50%组和70%组细胞活力明显高于CSE组，凋亡率明显低于CSE组，但90%组较CSE组细胞活力明显降低，凋亡率明显增加。从体外实验进一步证实了50%和70%浓度的氧疗可改善COPD，当氧疗浓度到90%时反而会加重COPD带来的损伤。

综上所述，COPD大鼠在氧疗浓度为50%和70%时可抑制COX-2/PEG2/EP信号通路的激活，改善COPD大鼠肺功能，减轻肺部炎症浸润，增加上皮细胞活性，且70%浓度氧疗效果最好；但氧疗浓度为90%时会加重COPD大鼠肺部炎症浸润，降低上皮细胞活性，促进COX-2/PEG2/EP信号通路的激活。