水产养殖病害快速检测技术研究※

●钱诗悦 曹 梅※※ 王兴强 李佳阳 朱碧莹 李 永 叶建生

（1.江苏海洋大学海洋科学与水产学院 江苏 连云港 222006；2.连云港侨海渔业科技有限公司 江苏 连云港 222045；3.江苏农牧科技职业学院水产科技学院 江苏 泰州 225300）

水产品是人类食物的重要组成部分。水产品的营养价值极为丰富[1]，其为人类提供的蛋白质超过人体动物蛋白质摄取总量的50%[2]。目前我国水产养殖面积超700万公顷[3]。但当前水产养殖也存在各种各样的问题，如养殖空间不足，养殖品种单一，养殖病害频发等。缺乏养殖空间使人们将目光投向高密度水产养殖，高密度水产养殖加大了病害防治的难度。目前水产养殖病原快速检测技术主要有两大类：免疫学检测技术和分子生物学检测技术。

1 免疫学检测技术

免疫学检测技术的原理是抗原抗体的特异性反应，也被称为血清学反应[4]，可对免疫相关的各种细胞进行特定分析。该技术在水产养殖病原检测领域有着广泛的应用。

20世纪中后期，Köhler和Milstein发现并创立了单克隆抗体技术，对生物医学产生了划时代的影响[5]。单克隆抗体技术现可用于检测水生动物病毒性疾病﹑细菌性疾病以及寄生虫病[6]。因为单克隆抗体检测病毒存在一些困难，所以多结合免疫酶联吸附试验技术（ELISA）和免疫荧光技术等进行。黄倢等[7]应用单克隆抗体的ELISA技术检测暴发性皮下造血组织坏死病（Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Baculo Virus，HHNBV），结合相应的单抗对山东﹑辽宁等地的虾池样品进行检测，结果显示，虾池的发病情况与检测阳性结果基本相符，少数存在差异，已发病的虾池检测出阴性结果说明发病的虾池中也有未感染病毒的对虾，而未发病的虾池检测出阳性结果说明病原已进入虾池，这符合流行病学规律。Lapatra等[8]研发采用单克隆荧光抗体试验检测鱼类传染性造血器官坏死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV），通过对待测样品的脂肪进行检测得出结果。荧光抗体技术在特异性﹑灵敏度﹑检测速度等方面都具有一定的优势，但是该技术的仪器价格高且功能不丰富，操作起来步骤多，无法进行非特异性染色，染色标本有效期短。

查智辉[9]研究采用间接荧光抗体方法检测三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）的血卵涡鞭虫（Hematodinium），能够有效检测出血卵涡鞭虫阳性。辛志明[10]等利用从发病的日本鳗鲡（Anguilla japonica）肝脏中分离的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）制备单克隆抗体，该方法操作简单﹑检测时间短，适合基层生产一线临床检测。

免疫学检测技术在病原检测方面的应用相较于分子生物学优势并不明显，因为免疫学检测技术的成本相对较高，且操作复杂。免疫学技术的优势体现在对免疫缺陷病﹑超敏反应﹑移植排斥反应﹑肿瘤等人类疾病的检测，免疫分子的定性定量测定，抗原物质的定性﹑定量检测，T细胞及其亚群免疫细胞的分离﹑鉴定及功能测定，这些比水生动物病原检测的要求更高[11-12]。但是相较于分子生物学检测技术，免疫学技术在速度和成本上就稍逊一筹。

2 分子生物学检测技术

随着分子生物学的发展，其在各个领域有了广泛的应用，尤其在检测方面的应用相当丰富。分子生物学检测技术通过对病原体的核酸进行精准的识别匹配来进行检测[13-16]。最早出现的分子生物学检测技术是核酸杂交技术，后衍生出基因芯片技术，如今分子生物学检测技术主要有两个路径，即PCR扩增技术和环介导等温扩增技术。

2.1 核酸杂交技术

核酸杂交技术根据检测样品的不同可分为DNA印迹杂交和RNA印杂交，核酸杂交技术在1961年问世，在特定反应体系中放入探针和靶序列进行反应，通过梯度离心获得对应产物，这种方法速度较慢，步骤多且结果不够精确。1962年Bolton等设计出固相杂交方法，探针是做了特殊标记的DNA或RNA序列，与病原体核酸中互补的靶核苷酸进行杂交，以检测核酸样品中的特定基因序列。吕玲等[15]建立了检测白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）的原位杂交方法，采用原位杂交检测的方法对对虾的各个部位进行检测，原位杂交结果均为阳性；研究结果表明，短探针敏感性较高，长探针敏感性降低，探针过长会使结果产生偏差。

核酸杂交技术目前还存在一些问题，每检测一种病原体都要制备一种核酸探针，样品的制备步骤复杂且耗时长，对样品的要求高，样品的纯度﹑目标基因的浓度﹑杂质含量等都会影响探针的检测结果，相较于其他检测方法，检测的速度﹑敏感性都会成为劣势。

2.2 基因芯片技术

基因芯片又叫DNA芯片﹑生物芯片技术就是核酸技术衍生出的新技术，基因芯片技术是将大量探针分子固定到玻璃片﹑硅片﹑聚乙烯膜等支持物上，样品分子进行标记之后与支持物上的探针分子进行反应，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取反应结果。基因芯片技术的操作步骤是在一块基片表面固定想要测定的各种已知序列的靶核苷酸的探针，将待测样本中的mRNA提取后，通过反转录反应过程获得标记荧光的核酸序列，然后与基片上的探针进行杂交反应，再将基片上未进行互补结合反应的片段洗去，对基片进行激光共聚焦扫描，测定芯片上的各点的荧光强度来推算待测样品中的各种基因的表达量。Stanford School of Medicine的cDNA芯片和Affymetrix公司的寡核苷酸芯片是目前最常用的两种芯片。基因芯片的应用非常广泛，可用作疾病的诊断和治疗，药物筛选﹑农作物的优育优选﹑司法鉴定﹑食品卫生监督﹑环境监测等，该技术在药物及基因筛查等涉及人类生命健康的应用上时品质要求非常高，技术难度也相当大，但是将基因芯片技术应用到水生动物病原检测中则可以降低标准，使其成本，效率能够契合水产动物病原检测要求即可。

宋居易等[16]将多重PCR单链扩增技术和基因芯片技术相结合，建立了南美白对虾4种病原体可视化快速检测检测方法，其中包括对虾急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌﹑对虾白斑综合征病毒﹑对虾传染性皮下造血组织坏死病毒﹑对虾肝肠孢虫，该方法将基因芯片技术进行改进简化，多重PCR单链扩增技术与独特的生物芯片技术结合，成本降低，检测指标多，速度快，灵敏度高，该技术还将荧光标记改换成生物素与标记有磷酸脂酶的链酶亲和素结合可在底物显色液作用下显色，从而达到可视化目的。

基因芯片技术虽然较为复杂，但其应用范围非常广，可根据需要进行优化，值得进行更多的研究。

2.3 PCR扩增技术

PCR扩增技术是分子生物学中发展最快﹑应用最广泛的技术，其可分为常规PCR技术﹑巢式PCR技术﹑荧光定量PCR技术﹑原位PCR技术等。

2.3.1 常规PCR技术常规聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术主要通过体外的酶促合成产物特异性的DNA片段，产物通过电泳出现条带则代表结果为阳性，电泳后未出现条带则表示结果为阴性。JEE Y L等[17]采用常规PCR技术对创伤弧菌进行鉴定；Beaz H R等[18]采用常规PCR技术检测鲑鱼杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida），该方法是以黏液为靶组织的无损检测方法，对于感染鱼体和无症状携带鱼体都能够进行特异﹑灵敏﹑快速的检测。彭宣宪等[19]以细菌通用16 s保守区特异性引物，以大肠杆菌和双歧杆菌为参照，建立起可以检测出嗜水气单胞菌﹑柱状曲桡杆菌（cytophaga columnaris）等6种常见鱼病病原菌的检测技术，该方法也是依托于常规PCR技术。

常规PCR技术与免疫学方法相比，特异性和灵敏度都大大提高，缺点在于常规PCR技术中引物的非特异性扩增会导致的假阳性﹑假阴性结果，该技术还不能获得定量结果。所以常规PCR技术与其他新型的PCR技术相比存在较大劣势。

2.3.2 巢式PCR巢式PCR是设计两对引物对目的基因进行扩增，其优势在于可以增加反应的特异性。李文杰等[20]根据Genbank中已发表的白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）VP28基因序列设计相应的巢式PCR引物，建立的检测克氏原螯虾（Procambarus clarkii）WSSV的巢式PCR方法，试验证明，巢式PCR方法的灵敏度是普通一步PCR方法的1000倍，检测限达到36 pg；樊晓琳[21]建立了巢式PCR方法，可以快速检测副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus），可在4 h内完成样本检测，节约培养菌的时间；谢亚君等[22]对比了普通PCR﹑双重PCR﹑巢式PCR﹑荧光定量PCR以及环介导等温扩增五种方式检测Ⅱ型鲤疱疹病毒的灵敏度和阳性检出率，发现荧光定量PCR和巢式PCR的灵敏度和阳性检出率最高，普通PCR和双重PCR灵敏度相对低一些。罗明菊等[23]为了预防大口黑鲈（Micropterus salmoides）双RNA病毒建立了巢式RT-PCR检测方法，试验中发现第二轮扩增灵敏度比第一轮扩增高10000倍，该方法的特异性也相当高，对大口黑鲈双RNA病毒预防和早期检测非常有利。

2.3.3 实时荧光定量PCR技术实时荧光定量PCR技术是一种可以对目标模板进行定量分析的一种PCR技术，该技术通过在PCR反应体系中加入荧光基团，在PCR反应过程中对荧光信号进行实时检测，最后通过标准曲线分析得出定量结果，实时荧光定量PCR有SYBRGreen Ⅰ法和Taqman探针法两种检测方法[24-25]。荣小军[26]建立了迟缓爱德华氏菌（Edwardsiella tarda，E.tarda）的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法，灵敏度高，定量准确。SYBR Green Ⅰ实时定量法相较Taq Man探针法，操作更简单，价格较低，不需要设计探针，只需要在反应混合液中加入引物和待测样品的DNA，该方法对人工感染的大菱鲆病样进行检测展现了较好的实用性。李惠芳等[27]建立了检测斑点叉尾鮰病毒株（Channel Catfish Virus，CCV）的荧光定量PCR检测方法，根据Genbank设计引物和TaqMan荧光探针，可在3 h内检测出结果；安伟等[28]建立检测鲤春病毒血症病毒（Spring Viraemia of Carp Virus，SVCV）的SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR方法，该方法特异性强﹑灵敏度好﹑重复性好，还降低了实验成本。

荧光定量RT-PCR技术优点非常多，反应的全封闭性，自动化程度高，不需要电泳所以毒性较小，整个过程非常不超过3 h，且同一批次可检测多个样品，但是要注意样本间的互相污染问题。

2.4 环介导等温扩增技术

环介导等温扩增技术（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）的特点是该技术是在等温条件下进行的扩增反应，利用4条引物在双链DNA上进行成环扩增，LAMP需要4～6条引物，引物区别在于有无Loop F/B。这些引物要与目标DNA/RNA的特定部位互补配对，扩增启动从内部引物入侵开始，链置换型DNA酶会将该引物延伸，使双链DNA解开，外部引物会将合成的链替换下来，并开始新DNA的延伸，当合成的链被替换下来，其链端会形成自杂交的环状结构。这是因为被替换下来的引物端中包含一个反向互补序列，引物延伸和链置换会交替发生在靶序列的两端，最终的产物是短哑铃结构的DNA，它可以作为扩增的起始结构，该环状结构包含多个起始位点，扩增会在多位点启动，新DNA迅速合成并形成多联体，且都有多个起始位点，最终双链DNA和扩增副产物迅速累计，产物检测有多种方法。

Gunimaladevi等[29]建立了检测虹鳟传染性造血坏死病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus，IHNV）的反转录环介导等温扩增和环介导等温扩增检测方法，在同等条件下两种方法的结果近似，灵敏度比传统巢式PCR技术高10倍。Min Z等[30]建立了能够检测3种蛙病毒的环介导等温扩增检测技术，且不会与非目的病毒发生反应，最低检测限度为100拷贝数/μL。LAMP的优势在于检测的灵敏度很高，可以检测到fg级别的核酸量，且成本较低，但是LAMP的特异性还有待提高。

3 总结

在科技飞速发展的当代，检测技术层出不穷，实现水产养殖病原检测变得容易。以免疫学为例，相较传统的微生物技术，免疫学检测技术灵敏度高﹑特异性强﹑速度快。免疫学技术在水生动物领域的应用优势体现在疫病防治，免疫学疫苗的使用通过增强生物体的体质，这样可以减少经常用药对水产品带来的负面影响，还可以研发免疫品种，免疫学技术在水产养殖业的前景非常广阔。分子生物学检测技术是检测技术中的佼佼者，无论是成本﹑速度﹑灵敏度﹑高通量性都是最优选择，且分子生物学检测技术类型多，各有特点，能够符合多种检测需求。分子生物学检测技术在水生动物疫病检测中的应用越来越多，对水产养殖的疫病防控具有重要意义。