巴氏新小绥螨转录组SSR位点分析及开发

摘要：【目的】开发巴氏新小绥螨（Neoseiulus barkeri）高效氯氟氰菊酯抗药和敏感品系的微卫星（SSR）分子标记， 为其抗药性基因遗传分析和抗药性品系的快速鉴定及筛选提供理论基础。【方法】应用MISA对巴氏新小绥螨转录组 已注释的Unigenes数据进行搜索，高通量挖掘该螨的SSR位点。使用Primer 5.0进行SSR引物设计，随机挑选其中 25对引物对巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系SSR位点基因进行PCR扩增，用重复性和稳定性高的12对引物进行实时荧光定量PCR分析基因表达。【结果】2个品系共获得52741条Unigenes，且SSR位点数量和分布密度一致。共筛选出5483个SSR位点，分布在4276条Unigenes中，发生频率为8.11%。主要重复类型为三核苷酸重复，占SSR总数的43.75%。共发现81种重复基元，其中单核苷酸重复基元A/T出现频率最高，占总量的19.65%。基于筛选出的SSR，共设计出4570对SSR引物，随机挑选的25对引物中有23对可扩增出巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系的目的基因片段。实时荧光定量PCR扩增结果显示，巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性品系有8个SSR基因位点的表达量高于敏感品系，其中TRINITY_DN24111_cO_g1基因的相对表达量为4.11，极显著高于敏感品系（1.06） （Plt;0.001，下同）；有4个SSR位点基因的相对表达量低于敏感品系，其中TRINITY_DN20624_cO_g1基因的相对表达量为0.68，极显著低于敏感品系（1.01）。【结论】巴氏新小绥螨转录组SSR位点多态性丰富，已筛选开发出的12对在巴 氏新小绥螨抗性和敏感品系中表达量不同的SSR特异性引物可应用于对各地巴氏新小绥螨种群对高效氯氟氰菊酯 抗药性的快速检测。

关键词：巴氏新小绥螨；SSR；高通量测序；序列分析；表达量

中图分类号：S476.2

文章编号：2095-1191（2024）03-0689-10

文献标志码：A

Analysis and development of SSR loci based on transcriptome of Neoseiulus barkeriLIU Hui1， LI Xia1， WU En2， CHANG Jing1*， LI Zhi-ping2， HUO Zhi-jia1，LI Gui-ying3， WU Jian-hua4

（1College of Horticulture and Plant Protection， Inner Mongolia Agricultural University， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China;2Agriculture and Animal Husbandry Technology Promotion Center of Inner Mongolia AutonomuousRegion， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China;3Hohhot Agriculture and Animal Husbandry TechnologyPromotion Center， Hohhot， Inner Mongolia 010020， China;4Bayannnur Modern Agriculture and Animal Husbandry Development Center， Bayannnur， Inner Mongolia 015001， China）

Abstract： 【Objective】 The aim of this study was to develop microsatellite （SSR） molecular markers for Lambda- cyhalothrin resistant and susceptible strains of Neoseiulus barkeri， and to provide theoretical basis for genetic analysis of resistance genes and rapid identification and screening of resistant strains. 【Method】All unigenes from the transcriptome of N. barkeri were scanned using MISA software and its microsatellite （SSR） loci was screened by high-throughput. SSR primers were designed using Primer 5.0 software， 25 of these primer pairs were randomly selected for PCR amplification of the SSR loci genes for Lambda-cyhalothrin resistance and susceptible strains， and real-time fluorescence quantitative PCR gene expression analysis was conducted with 12 primer pairs with high reproducibility and stability. 【Result 】A totalof 52741 unigenes were obtained from the two strains， and the number and density of SSR loci were consistent. A total of 5483 SSR loci were detected from transcriptome， whose occurrence frequency was up to 8.11%， the analysis found that these loci were distributed in 4276 unigenes. SSR repeat types was mainly trinucleotide repeats， which accounted for 43.75% of the total number of SSR. A total of 81 kinds of repeat motifs were found， A/T was the most dominant motif in nucleotide repeats， accounting for 19.65% of the total， and 4570 SSR primers were designed， 23 pairs out of all 25 pairs randomly selected SSR primers could amplify the target gene fragments of both Lambda-cyhalothrin resistant and susceptible strains of N. barkeri. The results of real-time fluorescence quantitative PCR showed that the expression of 8 SSR loci genes of the Lambda-cyhalothrin resistant strains was higher than that of the susceptible strains ， and the relative expression of TRINITY_DN24111_cO_gl gene was 4.11， extremely significantly higher than that of the susceptible strains（1.06） （Plt;0.001， the same below）. There were 4 SSR loci genes with lower relative expression than the susceptible strains， the relative expression of TRINITY_DN20624_c0_gl gene was 0.68， extremely significant smaller than the susceptible strains （1.01）. 【Conclusion】The SSR loci in the transcriptome of N. barkeri are rich in information.The screened and developed 12 SSR specific primer pairs that express at different levels in N. barkeri resistant and sensitive lines can be applied to the rapid detection of Lambda-cyhalothrin resistance of N. barkeri.

Key words： Neoseiulus barkeri;SSR;high-throughput sequencing;sequence analysis;expression level

Foundation items： Natural Science Foundation of Inner Mongolia Autonomuous Region （2023LHMS03016） ; Post-graduate Research Innovation Project of Inner Mongolia Autonomuous Region （S20231111Z）

0 引言

【研究意义】“以虫治虫”的生物防治方法是高效 且对环境友好的害虫综合防治方法之一。目前，全 球有230多种商品化天敌昆虫，其中蜱螨类天敌有 30余种（Chen et al.，2023），巴氏新小绥螨（Neosei- ulus barkeri）在许多农业生态系统中广泛应用于小 型害虫、螨及线虫的防治（王蔓等，2019；侯栋元等， 2020;王恩东等，2020;张丹等，2021;Azandeme-Hounmalon et al.，2022），被称为最有效的蜱螨类生物防治天敌之一（Tian et al.，2019）。但巴氏新小绥 螨对多种杀虫（螨）剂都非常敏感（张倩等，2022），经 常在化学药剂防治害虫（螨）的同时被杀伤，甚至死 亡。因此，室内筛选培育抗药性巴氏新小绥螨品系 并在田间释放，对螨虫防控具有极高的应用价值。 为实现这一目标，本研究在室内筛选巴氏新小绥 螨高效氯氟氰菊酯抗性品系的基础上，对巴氏新小 绥螨抗性和敏感品系进行转录组高通量测序，并对 其简单重复序列（Simple sequence repeats，SSR）特征 进行分析和基因验证，研究结果对巴氏新小绥螨 SSR分子标记开发、抗药性遗传功能分析和抗药性捕食螨快速鉴定及筛选等具有重要意义。【前人研究 进展】SSR又称微卫星（Microsatellite）DNA或简单 序列长度多态性（Simple sequence length polymor- phism），是由1～6个核苷酸基序多次串联重复而形 成的一段DNA序列（Kalia et al.，2011；刘昭阳等，2016），广泛存在于真核生物的核基因组中（Jarneand Lagoda，1996），该基因具有共显性遗传、高多态 性、变异性和跨物种转移能力的适宜性特征，可用于 许多生物类群的群体遗传学和生态学研究（柯富士，2013; Nigam et al.， 2017; Simonato et al.， 2019） 。Ouyang等（2021）对桔小实蝇进行转录组测序，并对SSR进行筛选和验证，结果显示，随机选择的80对SSR引物扩增出条带清晰、多态性良好的引物41对，为开发高多态性SSR分子标记研究桔小实蝇群体遗传结构和遗传多样性打下了基础。Yang等 （2021）根据已筛选获得的刺槐叶瘿蚊广腹细蜂（Platygaster robiniae）的SSR分子标记，选取采自丹 东和成都的2个地理分离群体对其遗传分化情况进 行研究，结果发现，所应用的SSR中有34个具有多 态性，平均存在4个基因型，且2个种群中的部分个 体单独聚类在1个分支上，表明2个群体间存在基因 流动和遗传分化。目前许多昆虫在转录组测序基础 上成功筛选到SSR位点，如桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）（魏丹丹等，2014）、东方粘虫（Mythimna separata）（李微等，2017）、印度谷螟（Plodia interpunc- tella）（唐培安等，2017）、甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）（王明明等，2021）、褐软蜡蚧（Coccus hesperi- dum）（李冬芝等，2022）、中华大仰蝽（Notonecta chi- nensis）（李敏等，2022）和李白盾蚧（Pseudaulacaspis prunicola）（杜炫星等，2023）等，这些研究结果将为各类昆虫种群遗传结构、昆虫特定基因定位及基因 功能分析等研究打下良好基础。【本研究切入点】本 研究团队前期筛选获得了巴氏新小绥螨高效氯氟氰 菊酯的抗药性品系，并应用杂交回交方式初步分析 了其遗传方式（常静等，2021），但该方法只能初步推 测害虫（螨）的抗药性是单基因控制还是多基因控 制，缺乏真正的分子水平验证，且用时长，数据处理 繁琐。【拟解决的关键问题】应用MISA对巴氏新小 绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系转录组数据中的SSR位点进行挖掘，筛选出与巴氏新小绥螨抗药性形成密切相关的SSR分子标记，为巴氏新小绥螨 抗药性基因遗传分析和抗药性品系的快速鉴定及筛 选提供理论基础。

1材料与方法

1.1试验材料

巴氏新小绥螨敏感品系（CS）：于内蒙古农业大 学园艺与植物保护学院有害昆虫生物防治实验室， 在不接触任何杀虫（螨）剂的条件下，采用甜果螨（Carpoglyphus lactis）饲养繁殖120余代。巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性品系（CR）：从亲代中挑选巴氏新小绥螨雌成螨，以亚致死浓度（LC2）的高效 氯氟氰菊酯原药处理雌成螨，经过21代筛选，获得 相对于敏感种群57.9倍抗性的抗药性品系。

1.2DNA提取

分别收集2个品系巴氏新小绥螨雌成螨，使用 天根DP304动物基因组DNA提取试剂盒提取巴氏新小绥螨基因组DNA，提取的DNA经NanoDropOne/OneC微量核酸蛋白浓度测定仪[赛默飞世尔科 技（中国）有限公司）]检测合格后，于-20°℃保存备用。

1.3转录组数据

巴氏新小绥螨转录组第2代高通量测序委托生 工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.4SSR筛选

应用MISA从巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯敏 感品系的Unigenes中筛选SSR位点，对筛选的SSR 进行统计分析。筛选标准：单碱基重复次数≥10、 2碱基重复次数≥6、3～6碱基重复次数≥5，复合型 SSR间隔不超过100bp。

1.5SSR位点验证

1.5.1引物设计

基于筛选的SSR，使用Primer5.0进行SSR引物设计。引物设计标准：引物长度16～22bp；产物长度111～261bp；引物退火温度53～ 60℃。为验证所设计的引物能否稳定扩增，从设计 出的引物中随机挑选25对引物进行验证。引物由 北京擎科生物科技有限公司合成。

1.5.2PCR反应PCR反应

体系20.0μL：巴氏新 小绥螨DNA模板2.0 uL，2×Tag Master Mix 10.0 uL，上、下游引物（10umol/L）各0.8μL，ddH2O补足至20.0μL。扩增程序：95℃预变性5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，进行35个循环；72℃延伸 5min，4℃保存。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳 检测。

1.5.3实时荧光定量PCR检测

使用MonAmpTM SYBR®Green qPCR Mix试剂盒（莫纳生物科技有限公司）进行实时荧光定量PCR检测。反应体系20.0 uL：MonAmpTM SYBR® Green qPCR Mix 10.0 uL，上、下游引物（10umol/L）各0.4μL、cDNA模板2.0μL，ddH2O7.2μL。扩增程序：95℃预变性30s；95℃10s，60°℃30s，进行40个循环。使用2AAa法计算 12个基因的相对表达量。

2结果与分析

2.1巴氏新小绥螨SSR基元数量及分布密度

巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系 转录组测序组装结果显示，2个品系共获得52741条 Unigenes，且SSR位点数量和分布密度一致。应用MISA对其进行检索，共找到5483个SSR位点，分布 在4276条Unigenes中，发生频率（含有SSR的Unige-nes数量与总Unigenes数量之比）为8.11%。其中含1个SSR位点的Unigenes序列有3487条，含2个及以上SSR位点的Unigenes序列有789条，以复合型形式存在的SSR序列有388条。

由表1可看出，巴氏新小绥螨转录组SSR重复 类型丰富，共存在6种核苷酸重复，其中三核苷酸重 复在总SSR中出现频率最高，为43.75%；其次是单核苷酸，占SSR总数的22.90%；五核苷酸和六核苷 酸重复的含量少，仅为0.29%和0.06%。巴氏新小绥螨转录组SSR位点各重复类型的重复次数各不相 同，重复次数主要集中在5～15次，所占比例为98.51%； 大于15次的仅占总数的1.47%。其中各重复类型重 复次数为5次的SSR占比最大，为35.11%。

在巴氏新小绥螨转录组数据中，SSR基元长度 主要集中于10～20bp（图1）。其中，序列长度为13～ 20bp的SSR有2929个，所占比例最多，为53.42%；其次是长度为10～12bp的SSR，有1400个，占SSR总 数的25.53%；序列长度大于20bp的数量最少，仅有 1154个，占SSR总数的21.05%，且多数为复合型SSR。

2.2巴氏新小绥螨SSR分布特点

在巴氏新小绥螨转录组SSR中共获得81种重 复基元。单核苷酸重复中，有A/T、C/G2种基元，其中A/T基元在巴氏新小绥螨转录组SSR中的出现频率最高，占总数的19.65%；二核苷酸重复中，有AT/TA、AC/GT、AG/CT、TC/GA、TG/CA和CG/GC共6种基元，其中TC/GA和AG/CT基元占比较多，分 别占总数的5.36%和5.30%；三核苷酸重复中包含30种基元，其中CAG/CTG、TGC/GCA和TTG/CAA基元占比较多，分别占总数的4.04%、3.96%和3.10%； 四核苷酸重复中的基元类型最多，共有37种，但各类 基元均占比较小；五核苷酸重复有AAAAC/AACAA/ ATTTA、 AAGTG/TCGAC/TGGTA 和 TGATT/CGGGA/ CGCCG等5种基元类型，六核苷酸重复仅有ATGGTT/ATGGAG/GTAAAG1种基元类型，各类型五核 苷酸基元与六核苷酸基元占比相同，均为总量的 0.06％（表2）。

2.3巴氏新小绥螨SSR引物设计与PCR验证

根据已设置好的参数，共设计出4570对SSR引 物。随机挑选25对引物对巴氏新小绥螨高效氯氟 氰菊酯抗性和敏感品系DNA进行扩增，结果（表3 和图2）显示，23对引物在巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系中均可成功扩增出与预期片段 大小一致的特异性片段，TRINITY_DN25202_cO_g9（编号13）和TRINITY_DN22589_cO_g1（编号17）均 未扩增出特异性条带。

2.4巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感 品系SSR位点基因相对表达量分析结果

选取表3中前12对引物，应用实时荧光定量PCR 测定巴氏新小绥螨抗药和敏感品系位点SSR基因表达情况，结果（图3）显示，12对引物在巴氏新小绥螨 高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系中扩增出的基因相 对表达量各不相同。高效氯氟氰菊酯抗性品系的TRINITY_DN20904_cO_g1 TRINITY_DN24134_c1 g2、TRINITY_DN23943_c1_g1、TRINITY_DN24111c0_g1、TRINITY_DN26079_c0_g1、TRINITY_DN22 260_cO_gl、TRINITY_DN25142_cl_g3和TRINITY DN16203_c0_g1等8个基因的相对表达量高于敏感 品系，其中TRINITY_DN24111_cO_g1基因的相对表达量为4.11，极显著（Plt;0.001，下同）高于敏感品系（1.06）。抗性品系的TRINITY_DN20624_c0_g1、 TRINITY_DN20334_c0_g1、 TRINITY_DN14906_cO g1和TRINITY_DN3574_c0_g1等4个基因的相对表达 量低于敏感品系，其中TRINITY_DN20624_c0_g1基因 的相对表达量为0.68，极显著低于敏感品系（1.01）。

3讨论

SSR分子标记挖掘及其在昆虫进化过程和多样 性研究以及控制害虫保护益虫等方面具有重要的应 用价值。本研究通过高通量测序技术获得巴氏新小 绥螨转录组52741条Unigenes，在其中的4276条Unigenes中找到5483个SSR位点，SSR发生频率为8.11%。通常不同物种的SSR发生频率存在较大差 异，这与物种本身的特异性密切相关，同时也因高通 量测序标准不同、SSR筛选时参数设置不同或数据库挖掘工具不同而不同（Deng et al.，2018）。如扶桑绵粉蚧（Phenacoccus solenopsis Tinsley）为5.79% （罗梅等，2014）、桔小实蝇（Bactrocera dorsalis）为4.00%（魏丹丹等，2014）、沙葱萤叶甲（Galeruca dau-rica）为4.53%（张鹏飞等，2016）、齿缘刺猎蝽（Sclo- mina erinacea）为4.99%（黎东海和赵萍，2019），这些 昆虫的SSR发生频率均较低；而窄足真蚋[Simulium （Eusimulium）angustipes]（郭欢等，2018）、意大利蝗（Calliptamus italicus）（桑迪等，2020）和灰茶尺蠖（Ectropis grisescens）（王定锋等，2021）的SSR发生 频率均较高，分别为36.05%、17.58%和27.59%。

前人研究发现，具有大量短重复基元的物种具 有相对较高的进化水平（Tóth et al.，2000）。本研究结果显示，巴氏新小绥螨转录组SSR重复类型丰富，单核苷酸重复、二核苷酸重复、三核苷酸重复和四核 苷酸重复占所有重复类型的99.64%，具有绝对优 势，可见巴氏新小绥螨处于较高的生物分类阶层，具 有相对高的进化水平。巴氏新小绥螨转录组SSR重 复类型中最主要的是三核苷酸（43.75%），与德国小 蠊（Blattella germanica）（王晨等，2015）、二点委夜蛾 （Athetis lepigone）（Li et al.，2013）和云南切梢小蠹（Tomicus yunnanensis）（袁远等，2014）等昆虫一致， 三核苷酸在蛋白质编码区通常较其他重复单元类型 更稳定，很少产生编码框移动突变，且三核苷酸重 复是除单核苷酸重复外编码基因表达序列标签 （Expressed sequence tags，ESTs）中最丰富的微卫星， 可为生物遗传信息研究提供更丰富的基因表达信 息，对研究其代谢、抗逆性等生物过程的基因表达调 控具有更重要价值（Xu et al.，2012）。沙棘木蠹蛾 （Eogystia hippophaecolus）（崔明明等，2017）、意大利 蜜蜂（Apis mellifera ligustica）（郭睿等，2018）、梨小食心虫（Grapholitha molesta）（冷春蒙等，2018）和拟 环纹豹蛛（Pardosa pseudoannulata）（Li et al.，2020） 等具有丰富的二核苷酸重复类型，西花蓟马（Frankli-niella occidentalis）（段惠生等，2012）和家蚕（Bom- byx mori）（王晖等，2022）以单核苷酸为主，蜜蜂 （Apis）（李斌等，2004）以六核苷酸重复类型为主。可见，物种间SSR丰度、碱基组成和优势碱基类型的 差异与物种种类具有一定相关性。

为验证SSR的扩增稳定性，通常会在设计的所有SSR引物中随机挑选数个进行验证。郭睿等 （2018）随机挑选意大利蜜蜂的24对特异性引物对 3个不同来源的意大利蜜蜂幼虫进行SSR位点扩 增，有22对成功扩增出目的片段，证明利用转录组 鉴定SSR位点的方法可行且高效。冷春蒙等（2018） 在随机选择的20对梨小食心虫SSR引物中发现6对 可在2个不同地区的梨小食心虫种群中扩增出符合 预期的特异性片段，证明根据转录组数据开发出的 SSR分子标记可行。本研究从设计的4570对引物 中随机挑选25对引物对巴氏新小绥螨高效氯氟氰 菊酯抗性和敏感品系进行PCR扩增，选取12对引物 对巴氏新小绥螨高效氯氟氰菊酯抗性和敏感品系进 行实时荧光定量PCR验证，结果显示25对引物中有 23对引物能稳定扩增，结果显示8个基因在抗药性品系中表达量高于敏感品系，4个基因在敏感品系中 表达量高于抗性品系，这为巴氏新小绥螨高效氯氟 氰菊酯抗性遗传SSR分子标记筛选提供了更有价值 的信息，证明预测的SSR的实用性，同时也验证了转 录组数据的可靠性。

4结论

巴氏新小绥螨转录组中SSR数据全面充实，位 点数量多，出现频率较高，基元类型丰富，有助于开 发更多适宜的SSR遗传标记。已筛选出的12对在 巴氏新小绥螨不同品系中表达量不同的SSR特异性 引物可应用于对各地巴氏新小绥螨种群对高效氯氟 氰菊酯抗药性的快速检测。

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