一株c基因型牛副流感病毒3型病毒的分离鉴定

杨 巍，蒋 磊，董秀梅

1.东北农业大学动物医学学院/农业部动物疫病病原生物学重点实验室东北科学观测实验站，黑龙江哈尔滨 150030；2.辽宁省农业发展服务中心，辽宁沈阳 110032

牛副流感病毒3型（BPIV3）属于副黏病毒科、副黏病毒亚科、呼吸道病毒属，是一种能够引起牛的急性呼吸道疾病的病毒性病原。BPIV3有3种常见的基因型，包括a、b、c型，这三种基因型之间的差异很小[1]。在临床上BPIV3容易与其它病原发生混合感染，很少发现单独感染的病例。如果是BPIV3的单独感染，一般不表现出明显的临床症状，个别病例会有轻微的呼吸道症状。若是BPIV3与其它病原发生混合感染则病情恶化迅速，特别是细菌的继发性感染容易引起严重的呼吸道症状，最终导致死亡。近些年来，我国黑龙江、内蒙古等省在流行病学调查中发现，牛群中BPIV3的血清阳性率很高，其它一些省如山东、江西等也在牛群中检测到了BPIV3抗体的存在[2]。因此对于BPIV3的防治应引起高度重视,否则将严重危害我国养牛业的发展。

本研究中，我们从黑龙江某牛场中有呼吸道症状的病牛鼻拭子中成功分离到一株BPIV3。将分离株M基因与GenBank中已发表毒株的M基因进行同源性比较及进化树分析，结果表明分离株属于c基因型。我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 病料

病料样本采集于黑龙江某牛场患有呼吸系统疾病的病牛。

1.1.2 细胞和主要试剂

MDBK细胞由本实验室保存。DMEM培养基、胎牛血清购自Gibco公司，RNA提取试剂盒、2×Taq PCR试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、DNA marker等购自天根生化科技有限公司，反转录试剂盒、FITC标记的兔抗羊IgG购自赛默飞世尔科技公司，BPIV3抗体购自VMRD公司。

1.2 实验方法

1.2.1 病毒的分离纯化

先将无菌采集到的病牛鼻拭子放置于1 mLPBS中充分混匀，用0.22 µm的滤膜过滤除菌后接种于长满单层的MDBK细胞。盲传三代后对产生CPE的样本进行噬斑纯化[3]。纯化后的病毒在MDBK细胞上连续传代，收集各代病毒液放置于-80 ℃保存备用。

1.2.2 免疫荧光鉴定

用纯化后的病毒感染MDBK细胞，感染72 h后固定被感染的细胞，Triton-X-100透膜，BSA封闭后加入一抗（BPIV3抗体）孵育1 h，然后加入二抗（FITC标记的兔抗羊IgG）孵育1 h，最后用含有DAPI的封片剂封片，封片后样品用荧光显微镜进行观察[4]。

1.2.3 分离株生长情况的测定

用纯化后的病毒感染MDBK细胞，于感染后的不同时间点收取病毒，测定感染后病毒的生长情况。病毒滴度的测定方法如下：将收获病毒的上清液进行10倍稀释（10-1～10-10）；将MDBK细胞培养于96孔板上，长满单层后加入稀释好的病毒液，每个稀释度做8个复孔，每孔加入100 µL，使其在37 ℃的CO2培养箱中培养；同时设立阳性和阴性对照。每天观察细胞病变情况，5 d后用Karber法计算结果[5]。

1.2.4 引物的设计与合成

根据GenBank上已发表的BPIV3分离株SD0835（GenBank登录号：HQ530153）和NX49（GenBank登录号：KT071671） M基因序列，利用生物学软件Oligo和DNAStar设计一对引物。上游引物为：5’-GCCAATCAGTCCCTCGACAAA-3’，下游引物为：5’-TGTCCAGGCTGTCGGTGTTAC-3’。预期扩增片段大小为1 094 bp。引物由吉林库美生物技术有限公司合成。

1.2.5 RT-PCR

参照病毒RNA提取试剂盒说明书提取BPIV3病毒基因组RNA，参照反转录试剂盒说明书合成cDNA。以cDNA为模板使用上述设计好的引物进行目的片段的扩增。PCR反应体系为：上下游引物各1 µL，2×Taq PCR Master Mix Ⅱ 12.5 µL，DNA 模板 2 µL，dH2O 8.5 µL。反应条件为：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1.5 min，共35个循环，72 ℃延伸10 min。PCR产物置于4 ℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行鉴定。

1.2.6 扩增产物的测序与序列分析

样品送吉林库美生物技术有限公司进行测序，将测序结果与GenBank上已发表的序列进行比较，并利用Mega 6.0和DNAStar软件进行系统进化分析和同源性比较。

2 实验结果

2.1 接种BPIV3分离株的MDBK细胞的免疫荧光鉴定

MDBK细胞被病毒感染后48 h用间接免疫荧光法对被感染细胞进行鉴定。结果表明，细胞对照组中只有代表细胞核的蓝色荧光信号，而实验组中除了蓝色荧光信号外还发现了代表BPIV3感染的绿色荧光信号,证明分离到的病毒为BPIV3。

2.2 BPIV3分离株在MDBK细胞上生长情况的测定

用纯化后的病毒感染MDBK细胞，于感染后的不同时间点（0、12、24、48、72、96 h）收取病毒，测定病毒滴度并绘制病毒生长曲线。结果表明在感染后第72小时达到病毒最高滴度为5.62×108TCID50/mL。

噬斑纯化后的病毒在MDBK细胞上进行七次连续传代（P1～P5），比较各代次之间的病毒滴度。结果表明传至P5代病毒的滴度明显提升达到6.58×108TCID50/mL。

2.3 BPIV3分离株M基因的扩增

利用RT-PCR方法扩增出HLJ1分离株的M基因，PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析，与预期大小一致，为1 094 bp。

2.4 BPIV3分离株M基因的序列测定与分析

测序结果表明HLJ1分离株的M基因大小为1 056 bp，与BPIV3c型参考毒株NX49和SD0835同源性较高分别达到99.7%、99.1%，而与其它BPIV 3a和BPIV3b型参考毒株同源性较低为83.1%～85.8%（NM09（GenBank登录号：JQ063064）,Q5592（GenBank登录号：EU277658），TVMDL15（GenBank登录号：KJ647284），TVMDL60（GenBank登录号：KJ647289））。氨基酸同源性方面，HLJ1与NX49和SD0835的同源性均为99.7%，而与Q5592的同源性最低为96.3%。遗传进化分析表明，HLJ1与NX49和SD0835同属于c基因型。

3 讨论

在本研究当中我们采取患有呼吸系统疾病的病牛的新鲜鼻拭子，经放置在无菌PBS中混匀并滤膜除菌后，立即接种MDBK细胞，盲传三代后，能够产生典型的病变。分离到的病毒经噬斑纯化后，用间接免疫荧光方法进行鉴定，结果表明成功分离出一株BPIV3毒株。病毒感染MDBK细胞后，测定不同时间点的病毒滴度并绘制病毒生长曲线。我们发现在感染后0～72 h病毒增殖速度较快，并于感染后第72小时达到病毒最高滴度，72 h后病毒滴度逐渐回落，因此在进行病毒传代过程中，为获得最大滴度病毒，应在感染后72 h进行收毒。噬斑纯化后的病毒在MDBK细胞上进行5次连续传代，经比较各代次之间的病毒滴度发现，传至P5代病毒的滴度较之前明显提高。M基因是BPIV3的分型基因，在本研究中我们扩增出HLJ1的M基因，测序结果表明分离株的M基因为1 056 bp。利用生物学软件将HLJ1的M基因与GenBank上已发表的BPIV3参考毒株M基因序列比较后，结果表HLJ1与NX49和SD0835同属于c基因型。在本研究当中，我们从患呼吸系统疾病的病牛鼻拭子当中成功分离到一株c型BPIV3，我们的结果将为牛副流感病毒3型检测试剂盒及疫苗的研发工作奠定基础。