食源性致病菌天然抗生物被膜剂的研究进展

杨昌颖，吴亦菲，谢廷怿，刘娜娜，刘 欣，李卓思，董庆利，秦晓杰

上海理工大学健康科学与工程学院，上海 200093

食源性致病菌是引发食源性疾病的重要原因。据世界卫生组织报道，每年全球有近十分之一的人在食用受污染的食物后患病，每年导致超过10 万人死亡[1]。2011—2020年，我国由食源性致病菌污染引发的食物中毒事件累计达35 806 起，患病人数高达266 968 人，且患病率呈增长趋势[2]。在食品工业环境中，常见的食源性致病菌有沙门氏菌、大肠杆菌、副溶血性弧菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、单核细胞增生李斯特氏菌（简称单增李斯特菌）、阪崎肠杆菌等[3]。尽管已经常采取各种措施来控制致病菌，但由致病菌污染引发的食品安全事件仍在频繁发生。其中，病原体形成生物被膜是其能够逃逸外界压力的重要因素[4]。生物被膜是指在特定条件下，细菌依附于接触表面所形成的特殊结构，旨在适应环境并表现为一种特定的存在形态。

食源性致病菌生物被膜的形成与接触表面的性质（如表面电荷、表面化学组成及表面粗糙度等）、微生物种类及环境因素（如pH、温度及营养条件）等有关[5]。目前在控制食源性致病菌生物被膜方面的相关研究中，主要采用化学方法、物理方法以及生物方法来展开。由于生物被膜结构致密且细菌状态复杂，因此化学方法的清除效果相对有限。物理方法能够干扰食源性致病菌在非生物表面的附着，但仅能损伤细胞而不影响其附着性，这会导致清除不彻底。根据目前的研究结果，天然抗生物被膜剂，如噬菌体、植物提取物、抗菌肽等，在控制食源性致病菌生物被膜方面表现出显著效果。这些方法具有安全、高效、毒副作用小的特点，已成为食品安全领域的研究热点。

本文简述了食源性致病菌生物被膜的危害，归纳了天然抗生物被膜物质的种类及其作用效果，从降低细菌黏附能力、抑制群体感应系统（Quorum Sensing，QS）、 降解胞外聚合物（Extracellular Polymeric Substances, EPS）、破坏细菌细胞膜等方面阐述了天然抗菌剂对食源性致病菌生物被膜的作用机制，并对天然抗生物被膜剂未来的发展方向进行展望，以期为减少由生物被膜引发的食品安全事件提供参考。

1 食品工业中食源性致病菌生物被膜形成的危害

生物被膜是细菌黏附于生物或非生物接触表面所形成的由胞外聚合物EPS（如多糖、蛋白质或多肽、脂质和胞外DNA 等）包裹的大量细菌聚集群落[6]。生物被膜态的致病菌在恶劣环境下的生存能力和抵抗能力显著增强，并且难以被彻底清除，它们能够在食品加工环境中长久存活，加剧食源性疾病暴发的风险。近年来，全球范围内食物中毒暴发与食源性致病菌形成生物被膜潜在相关的案例如表1 所示。

表1 食源性致病菌导致的食物中毒暴发事件案例

表2 不同种类天然物质对食源性致病菌生物被膜的作用效果

2 天然抗生物被膜剂

2.1 噬菌体

噬菌体（phage）是一种天然的抗生物被膜剂，具有繁殖速度快、特异性强的特点，能快速杀灭细菌。Byun 等[14]用李斯特菌特异性噬菌体混合物来处理食品接触材料形成的生物被膜，8 h 后，生物被膜减少量超过2 log CFU/cm2。Pottker 等[15]将7 种噬菌体作用于12 株肠炎沙门氏菌，结果表明混合噬菌体对生物被膜的抑制水平最高可达88.53%。卢玮等[16]从新疆双峰驼粪便中分离纯化了4 个金黄色葡萄球菌（SA）噬菌体，当噬菌体与耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）共同培养时，细菌裂解率高达42.55%，且4 个SA 噬菌体对MRSA 菌株的生物被膜有明显的清除作用。将多种噬菌体混合使用或将噬菌体与化学物质混合使用可提高杀菌效果。

2.2 植物提取物

植物提取物是从植物中提取的天然物质，包括挥发油类、黄酮类、生物碱类、多酚类等。植物提取物主要通过影响细菌的表面黏附能力、群体感应和细胞内的能量代谢过程来抑制生物被膜的形成[17]。

2.2.1 挥发油类

精油是从植物中提取的挥发性芳香族油性液体，有较好的抑菌效果。洪小利等[18]表明在亚抑菌浓度下，肠炎沙门氏菌和单增李斯特菌的黏附性和群体感应信号分子AI-2 的活性显著降低了，且在1/2MIC 肉桂精油作用下两种细菌的信号分子AI-2分别减少了42.8%和37.6%，以此干扰生物被膜的形成。Sharifi 等[19]用麝香精油和香椿精油（EOs）处理肠出血性大肠杆菌（EHEC）时，在1.56 μg/mL 质量浓度下显著抑制了EHEC 生物被膜的形成，并导致luxS 和pfs 这两个基因明显下调，阻碍了细菌的QS系统。

2.2.2 黄酮类

黄酮类物质是研究最广泛的天然化合物之一，目前已发现了8 000 多种黄酮类化合物。柑橘中的黄酮，如山柰酚和柚皮素，已被证明能通过干扰酰基-高斯氨酸内酯（AHL）与其受体之间的相互作用，充当群体感应抑制剂（QSI），从而抑制大肠杆菌O157∶H7 和哈维弧菌的生物被膜的形成[20]。同样，在柑橘类黄酮柚皮素中，当金黄色葡萄球菌暴露于柚皮素时，细菌涂层会变薄，分离为单菌落。这种生物被膜的减少可能与细胞表面疏水性的改变和产生的胞外多糖减少有关，这与生物被膜的黏附性和形成有关[21]。

2.2.3 生物碱类

生物碱是结构上含氮的碱性有机化合物，大多有复杂的环状结构，常见于高等植物或中草药中。按照其结构分类，有吡咯类、吲哚类、嘌呤类、吡啶类和咪唑类等。利血平是常见的吲哚类生物碱，在测定其对铜绿假单胞菌PA01 生物被膜的影响时，利血平减少了细胞的运动、毒力因子的产生和控制QS 基因的表达[22]。Lee 等[23]研究了生物碱（哈马林和诺哈曼）对大肠杆菌O157∶H7 和铜绿假单胞菌PAO1的抗菌能力，通过聚焦和电子显微镜观察证实了哈马林和诺哈曼对生物被膜的抑制作用。

2.3 酶

食品工业中，常用抗生物被膜酶靶向清除生物被膜，不同的酶对生物被膜的作用效果往往不同。Park 等[24]发现，含蛋白酶的放线菌培养上清液对金黄色葡萄球菌的生物被膜抑制率超过80%，并能清除成熟的生物被膜。脱氧核糖核酸酶I（DNaseI）可以通过氧化还原反应靶向降解生物被膜基质中的eDNA，从而破坏生物被膜结构。Nguyen 等[25]发现用100 μg/mL 的DNaseI 处理单增李斯特菌生物被膜后，可诱导细胞不完全分散，加入蛋白酶K 时能完全抑制生物被膜生长。联合酶处理的抑制效果更加显著。Yuan 等[26]发现，联合抗生物被膜酶（脂肪酶、纤维素酶、蛋白酶K）对副溶血性弧菌生物被膜的抑制率和清除率分别为89.7%和66.9%，且组合酶还降低了胞外多糖的浓度并破坏了EPS 基质。

2.4 抗菌肽

抗菌肽是广泛存在于生物体内天然免疫系统中的一类小分子多肽，具有强碱性、抗菌光谱广泛、耐药性低等特点，常被运用于抗生物被膜的研究过程。王雪燕等[27]发现草鱼鱼鳞抗菌肽对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等细菌的穿膜率可达51.04%～72.76%，它可以通过影响细菌的生长周期来加速细菌衰亡。李会等[28]用鼠源性抗菌肽（CRAMP）对成熟的铜绿假单细胞（PAO1）生物被膜进行处理，在显微镜的观察下，经过CRAMP 处理的96 孔板的荧光强度显著降低，说明CRAMP 对PAO1 成熟生物被膜具有明显的清除效果。抗菌肽是一种类高效的抑菌物质，但其具有多肽属性，代谢稳定性差，易被蛋白酶水解。但有研究表示，通过设计抗菌肽的特定分子结构、避免酶切位点可减慢抗菌肽的水解速度，使其功效最大化[29]。

2.5 生物表面活性剂

生物表面活性剂是指在一定条件下培养微生物时，在其代谢过程中分泌出的具有一定表面活性的代谢产物。槐糖脂是一类由酵母生产的糖脂表面活性剂，它会削弱细菌的黏附性和EPS 基质，导致生物被膜表面脱落和破裂。乳酸菌生物表面活性剂（BS）不仅可以调控金黄色葡萄球菌群体感应系统信号分子AI-2 的释放，还能调控cid、ica 和agr 等基因的表达，从而影响金黄色葡萄球菌生物被膜的形成[30]。生物表面的活性物质主要通过降低菌株的黏附性、调控相关基因的表达和破坏细胞膜或生物被膜结构来控制生物被膜的形成。现有研究主要集中于生物表面活性物质对菌株黏附性和细胞膜的影响，对基因层面的研究则相对较少，今后可深入探究。

3 天然抗生物被膜剂的作用机制

总结现有天然抗菌剂对食源性致病菌生物被膜作用机制的研究，绘制图1，主要可概括为五个方面：（1）降低细菌表面黏附能力；（2）降低EPS 产率；（3）调控群体感应信号通路；（4）降解EPS 组分；（5）破坏细菌细胞膜。

图1 天然抗菌剂在食源性致病菌生物被膜形成与控制中的作用机制

3.1 降低表面黏附能力，阻止致病菌生物被膜的形成

天然抗生物被膜剂可通过降低细菌表面黏附能力和EPS 产率来阻止生物被膜的形成（图1）。其中，植物提取物、抗菌肽和生物表面活性剂抑制细菌生物被膜的黏附能力主要通过两种方式。第一，抑制细菌相关黏附基因的表达，从而降低生物被膜的形成能力。Ming 等[42]发现黄酮类物质山柰酚对金黄色葡萄球菌生物被膜形成的抑制率达80%，并减少了金黄色葡萄球菌相关黏附基因（clfA，clfB，fnbA，fnbB）的表达。抗菌肽不仅能降低耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）生物被膜形成初期的黏附性，还能降低MRSA 毒力因子和生物被膜形成相关基因fib 和多糖黏附素icaA 基因的转录水平[43-44]。第二，这些天然抗生物被膜剂通过改变细菌表面性质来降低其黏附能力。其中，精油和表面活性剂对生物被膜的黏附性的影响最为显著。Rossi 等[45]发现肉桂精油中的醛类物质通过共价交联DNA、蛋白质和胺基团来改变细菌细胞的正常功能，影响细菌的黏附能力。

3.2 降低胞外聚合物EPS 的产率，抑制致病菌生物被膜的形成

降低胞外EPS 的产量也是抑制生物被膜形成的重要方式。植物提取物、抗菌肽和噬菌体能够改变细胞膜的通透性从而影响胞外物质的产生，进而抑制细菌生物被膜的形成。例如，大黄素通过抑制金黄色葡萄球菌eDNA 的释放对生物被膜EPS 产生抑制作用[30]。抗菌肽可以抑制生物被膜胞外蛋白的合成与分泌，且抗菌肽的浓度越高抑制效果越强。此外，抗菌肽还能通过降低fib、icaA 基因的转录水平来降低生物被膜形成初期的黏附性，其中，icaA 会影响多糖黏附素的合成[43]，fib 蛋白可以调节MRSA的毒力因子并控制生物被膜的形成[44]。噬菌体可以通过刺激宿主细菌产生EPS 降解酶，进而分解细胞外基质中的多糖和蛋白质，促进其穿透、复制和消除存在于生物被膜内的细菌。

3.3 调控致病菌生物被膜形成的信号通路，抑制致病菌生物被膜的形成

生物被膜的形成主要通过几种信号通路来调节，如群体感应（QS）和核苷酸第二信使系统。一些植物提取物和降解酶可以通过调控信号通路，特别是细菌的群体感应QS 系统中相关蛋白的表达来阻断细胞间的信号传递。QS 系统是一种在细菌中广泛存在的机制，可以通过细菌分泌的信号分子来传递信息。天然类QS 抑制剂可通过抑制信号分子产生、降解信号分子、竞争性结合信号分子等方式干扰信号分子合成，从而有效抑制生物被膜的形成。

3.3.1 抑制信号分子产生

通过抑制QS 信号分子的产生来干预生物被膜的形成是一种常见的抑制生物被膜的途径。研究表明，从葡萄柚汁中分离得到的天然呋喃香豆素对AI-1 和AI-2 活性的抑制率高达95%，且能抑制大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和铜绿假单胞菌生物被膜的形成[46]。其中，LsrK 是一种AI-2 激酶，当外源性加入LsrK 和ATP 时，导致细胞外的AI-2 易被磷酸化，使其具有亲水性，从而阻止其穿过细胞膜发挥信号分子的作用[47]。

3.3.2 降解信号分子

酶降解QS 信号分子是抑制QS 系统最直接、最有效的方法，在革兰氏阴性菌中，AHL 可被AHL-内酯酶和AHL-酰化酶这两种类型的酶降解。Roy[48]证明，加入LsrK 和ATP 能显著降低大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌的QS 反应，其原因是AI-2 的磷酸化淬灭了细菌中的QS。在Kiran 等[49]的研究中，经内酯酶处理后铜绿假单胞菌的生物被膜的减少率从69.1%提升至77.34%，与抗生素（如环丙沙星、庆大霉素）联合使用效果更佳。

3.3.3 竞争性结合信号分子

信号分子与其受体的结合具有特异性，但一些信号分子类似物可与信号分子的结合蛋白产生竞争性结合，通过占据结合位点抑制信号分子的传递通路。研究表明，植物类黄酮柚皮素通过直接结合QS调节因子LasR 发挥作用，与其生理激活剂3OC12-HSL 竞争，损害铜绿假单胞菌中QS 调节的毒力因子和弹性蛋白酶等的产生[50]。天然呋喃酮在结构上与AHL 相似，其拮抗活性源于与天然自身诱导剂的竞争，结合后阻断AHL 受体，目前已证明可以减少细菌物种毒力因子的产生和生物被膜的形成[51]。

QS 是控制生物被膜形成的重要组成部分，不同细菌和信号分子对生物被膜的差异调节揭示了QS系统的复杂性。探索不同信号分子介导的QS 对细菌生物被膜形成机制的影响可以针对性地提出抑制生物被膜形成的解决措施，使QS 系统成为消除细菌生物被膜的潜在靶标。

3.4 降解EPS 组分

细胞外聚合物EPS，类似于细胞内物质，是致病菌用于自我保护的天然产物。当天然抗菌物质，尤其是降解酶作用于致病菌细胞时，通过降解EPS 组分来减小其对细胞的保护机制，从而清除成型的生物被膜。多糖、蛋白质、脂质和eDNA 是EPS 的重要组成部分，脂肪酶、纤维素酶、蛋白酶K 等降解酶经渗透作用进入生物被膜，通过降解或水解致病菌生物被膜形成过程中的必需物质达到清除生物被膜的目的。研究发现，DNA 酶和蛋白酶K 可降解单增李斯特菌生物被膜EPS 基质中的eDNA 和蛋白质，减少细菌的黏附[52]。Tiwari 等[53]发现熟猕猴桃的次级代谢物可降低鲍曼不动杆菌EPS 中胞外多糖、蛋白质及eDNA 的含量，进而清除微生物的生物被膜。通过降解酶降解EPS，可以清除成熟的生物被膜。

3.5 破坏细菌细胞膜

细胞壁膜是细胞间进行物质交换和信息交流的重要通道，对于维持微生物正常的生命活动发挥着非常重要的作用。噬菌体穿孔素和内溶酶是其在感染细菌的过程中出现的两种关键蛋白质，通常在感染后期协同降解细菌细胞壁成分，破坏细胞膜结构，使细胞溶解。植物提取物和一些微生物代谢物通过影响细胞通透性来破坏细胞膜的结构，使核酸和蛋白质等细胞内大分子从细胞中渗出，导致细菌死亡。Hayouni 等[54]表明鼠尾草根部和金参浆果根部提取的精油可以提高细胞膜的渗透性，使三磷酸腺苷渗出，细菌裂解，生物被膜被破坏。另外，Islam 等[55]用枯草芽孢杆菌乙酸乙酯提取物处理食源性致病菌成熟的生物被膜，发现枯草芽孢杆菌代谢产物可以穿透细菌细胞膜并唤起诱导细胞裂解，从而清除生物被膜。

4 结语

食源性致病菌生物被膜形成后，其黏合强度和黏附特性会使其难以彻底清除，对食品安全和公众健康造成严重威胁。传统的物理手段难以完全消除生物被膜，而长期使用化学手段则可能导致细菌产生抗性。因此，迫切需要安全有效的策略来控制食源性致病菌的生物被膜。当前，天然抗生物被膜剂以其良好的杀菌效果、清除生物被膜的能力以及对环境和人体无危害等优点成为控制生物被膜的潜在新型策略。降低细菌表面黏附能力和EPS 产率、抑制群体感应系统、降解胞外聚合物EPS 组分及破坏细菌的细胞膜结构和生理功能是天然抗生物被膜剂的主要作用机制。

尽管噬菌体、抗菌肽、植物提取物等在致病菌生物被膜的形成控制与清除方面极具潜力，但部分天然抗菌剂在抑制生物被膜形成的广谱性、持久性和稳定性方面存在一些不足，且现有研究多集中在对作用效果的探究上，针对天然抗菌剂对生物被膜的作用机制尤其是分子层面的解析不深入，未能从根源上找到控制措施。今后，针对天然物质抗生物被膜的研究可从以下几方面开展：1）进一步挖掘和开发高效广谱的天然抗菌剂；2）系统研究QS 对不同细菌信号分子相关基因及蛋白的动态调控，寻找抑制QS 系统的新方法，明确抑制生物被膜形成的复杂机制；3）探索天然抗生物被膜剂与其他方法（如光疗、抗生素等）的协同效应，提高生物被膜的清除效果；4）将使用天然抗菌剂与抗附着剂或生物界面材料相结合，开发具有抗生物被膜特性的新型材料，以降低致病菌形成生物被膜对食品安全的影响，保障公众的生命健康。