基于网络药理学探讨菊苣抗菌作用机制

吾尔麦提汗·麦麦提明，买买提明·买合木提，麦合皮热提罕·麦麦提明

1.新疆维吾尔医学专科学校，新疆 和田 848000；2.和田地区人民医院，新疆 和田 848000

菊苣为维吾尔族和蒙古族习用药材，亦是《中华人民共和国药典》中收载的中药材，来源于菊科植物毛菊苣或菊苣的干燥地上部分或根，具有清肝利胆、健胃消食、利尿消肿等功效[1]，在临床上对于湿热型肝炎、全身性水肿等疾病的治疗具有良好的效果[2]。

菊苣主要成分包括半萜类、黄酮类、香豆素类等。现代药理研究结果表明，菊苣可以控制血糖、血脂水平，并且能够有效预防心脑血管疾病，还能发挥抗癌效果。此外，有研究发现毛菊苣根对枯草芽孢杆菌、金色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌和大肠杆菌均有抑制作用[3]。从以上报告可以看出菊苣具有较强的抗菌作用，但是菊苣抗菌作用机制还未得到详细论证。

网络药理学指的是运用计算机、基因组学、拓扑学等方面的知识，通过构建疾病-基因-靶点-药物共同作用的网络，深度挖掘中药的药物机理、作用原理、毒性等特点的新兴学科之一，在阐明中药综合作用机制方面具有诸多优势[4]，并且其已成功地应用于阐明中医药的治疗机制。本文结合网络药理学方法分析菊苣抗菌作用机制，以期为后续进一步开展菊苣抗菌活性研究提供一定的理论基础和科学依据。

1 方法

1.1 菊苣有效成分筛选及靶点的预测

首先利用TCMSP 数据库检索菊苣中所有化学成分，进而设定筛选条件：OB≥30%、DL≥0.18，据此选择菊苣有效成分，随后使用TCMSP 数据库获取相应的靶点信息，通过GeneCards 数据库得到有效成分靶点的gene symbol。

1.2 抗菌基因靶点分析

将“antibacterial”设定为检索关键词，然后通过GeneCards 网站获取抗菌基因靶点。

1.3 菊苣“药物-成分-靶点-疾病”可视化网络的构建

根据筛选出的菊苣活性成分所对应的靶点和抗菌相关靶点，使用VENNY2.1 在线作图软件绘制韦恩图。选取菊苣活性成分对应的靶点基因与抗菌基因交集的部分，通过Cytoscape3.7.2 软件的应用，构建菊苣网络图。

1.4 菊苣抗菌的蛋白互作网络的构建

将菊苣有效成分抗菌靶点注释STRING 数据库，并将“Homosapiens”设置为物种类型，其他参数只需保持默认数据即可，以此建立蛋白互作网络(PPI)。把PPI 网络结果输入Cytoscape 软件中并利用cytoNCA 插件筛选出Degree 值排名前20 的关键靶点。

1.5 基因富集分析

将关键靶点注释metascape，将物种设定为“Homosapiens”，完成关键靶点GO 生物学富集分析与KEGG 代谢通路富集分析，然后使用微生信在线作图软件完成富集结果的条形图和气泡图的制作。

2 结果

2.1 菊苣有效成分及靶点的筛选结果

在TCMSP 中，基于DL≥0.18 且OB≥30%的条件进行筛选，合计获得12 个菊苣有效成分，具体情况见表1。在12 个菊苣活性组分中，共找到156 个靶点，将重复部分删除后，获得了100 个菊苣潜在靶点，菊苣成分ψ-taraxastero、cichoriosideB 并未匹配到合适的靶点。

表1 菊苣中12 种有效成分的基本信息

2.2 抗菌相关基因靶点的预测结果

在GeneCards 数据库中共搜索到抗菌相关基因靶点884 个。

2.3 菊苣“药物-成分-靶点-疾病’可视化网络的构建

将菊苣100 个潜在靶点和884 个抗菌基因靶点输入VENNY2.1 软件中绘制韦恩图，结果如图1 所示，两者取交后获得了46 个疾病—药物共同潜在靶点。利用这46 个共同潜在靶点，在Cytoscape3.7.2 软件的配合下完成“药物-成分-靶点-疾病”模型的建立（图2）。对测试结果进行分析可知：菊苣9 种有效成分在46 个抗菌靶点发挥抗菌功效均起到关键作用。其中，木犀草素、β-谷甾醇、（2R）-3-[3-（5-allyl-2-hydroxyphenyl）-4-hydroxyphenyl]propane-1,2-diol拥有最多的对应靶点。由此判断，3 种成分对于抗菌具有较强的功效。

图1 抗菌相关靶点与菊苣有效成分作用靶点的韦恩图

图2 “药物-成分-靶点-抗菌”网络

2.4 PPI 网络创建和核心基因筛选结果

使用STRING 数据库完成46 个共有靶点对应的PPI 网络，具体情况如图3 所示。该PPI 网络中共有46 个节点和489 条边，其中45 个靶点直接进入PPI 网络，剩余1 个靶点（LACTB）属于游离靶点蛋白，不参与PPI。将PPI 网络结果输入Cytoscape 软件中并利用cytoNCA 插件筛选出Degree 值排名前20 的关键靶点，Degree 值排名前20 的关键靶点蛋白包括白细胞介素-6、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、TP53 细胞肿瘤抗原、肿瘤坏死因子、胱天蛋白酶3、基质金属蛋白酶9、转录因子JUN、HSP90AA1、前列腺素G/H 合酶2、表皮生长因子受体等，说明上述蛋白之间的相互作用在网络中极其关键。

图3 抗菌靶点PPI 网络

2.5 GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析结果

GO 功能富集分析将Degree 值排名前20 的关键靶点输入metascape 中，将“Homo sapiens”设置为物种类型，以P＜0.01，最低富集数设计为1.5 进行关键靶点GO 生物学富集分析，得到生物过程为20个，细胞组分为6 条，分子功能为8 条，结果如图4所示。

图4 抗菌靶点GO 功能富集分析柱状

KEGG 通路富集分析将Degree 值排名前20 的关键靶点输入metascape 中，将“Homo sapiens”设置为物种类型，以P＜0.01，最低富集数设计为1.5 进行关键靶点KEGG 代谢通路富集分析，得到12 条信号通路，结果如图5 所示。

图5 抗菌靶点KEGG 功能富集分析气泡图

3 讨论

现代药理学及各方面研究结果表明，大部分中药抗菌的作用机理都是通过激活生物体内在的其他抗菌因子[5]来激发生物体免疫力，从而降低细菌毒副作用，并提高生物体自身抵抗细菌的能力和机体自我修复的能力，以达到抗菌的目的。虽然已有关于菊苣的抗菌作用的相关报道[3-4]，但其抗菌作用机制尚未得到过详细论证。本文采用网络药理学方法对菊苣中与抗菌有关的有效成分、作用靶点及生物信号通路情况进行研究，结合网络药理学预测了菊苣9 种有效成分在46 个抗菌靶点抗菌时起到主要作用，其中木犀草素、β-谷甾醇、MOL008539 拥有最多的对应靶点，由此推测，这3 种成分可能在抗菌过程中发挥关键作用。也有研究[6]发现，木犀草素能够发挥抗菌、抗病毒、抗炎症、抗氧化等作用。刘淼等[7]通过研究发现木犀草素可破坏细菌细胞膜，在浮游状态下导致细胞形态变动，进而帮助细胞内容物产生渗漏效果，以此提升抗菌的作用，其通过限制生物膜形成等方式来降低抗生物被膜活性。Lokadi Pierre Luhata[8]首次发现，从红楼花叶中分离出的β-谷甾醇对金黄色葡萄球菌具有抑菌效果。还有文献报道[9]β-谷甾醇具有抗真菌活性。虽然缺乏关于MOL008539（别名为Magnolignan A）的抗菌作用的相关报道，但莫斯喻等[10]表示厚朴具有保护神经、心脑血管以及抗氧化、抗菌、抗炎、抗溃疡、抗肿瘤等功效。通过这些报告可以推测出MOL008539 可能参与抗菌过程。此结果与以往文献报道相一致，因此进一步确定了菊苣通过这3 种活性成分作用于多个靶点发挥抗菌作用。

从PPI 网络分析的结果来看，PPI 网络Degree值排名前5 的关键靶点分别为白细胞介素-6、RAC-α 丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶、TP53 细胞肿瘤抗原、肿瘤坏死因子、胱天蛋白酶3。AKT1 被激活后参与细胞生长、代谢、增殖和凋亡等多种生物学过程，并且其属于重要信号通路[11]；IL-6 本身属于炎症细胞因子，对于炎症反应能够发挥重要的功能和效果，并能有效提升T 细胞、B 细胞的活性，同时刺激外援物质的识别应答功能，以此发挥抗菌消炎的效果[12]。肿瘤坏死因子可诱导某些肿瘤细胞的程序性死亡，在特定条件下能促进细胞增殖，提升细胞分化速度，并且能持续调整患者身体免疫效果[13]。胱天蛋白酶3 作为参与细胞凋亡过程的关键执行因子，广泛参与细胞凋亡的过程[14]。TP53 细胞肿瘤抗原会主动进行DNA 修复、细胞死亡促进等，对于机体免疫应答、炎症反应发挥着特定的功能[15]。因此可以得知菊苣的抗菌靶点通过促进细胞凋亡、刺激机体的识别应答、免疫调节等途径发挥抗菌作用。

从GO 功能富集结果来看，与抗菌有关的有效成分靶点主要集中在平滑肌细胞增殖的调控、神经元死亡的调控、蛋白质磷酸化的正向调控、凋亡过程的正向调控、炎症反应的调控上。由KEGG 通路富集结果来看，抗菌靶点主要富集在癌症通路方面，其次为脂质和动脉粥样硬化，人巨细胞病毒感染、南美锥虫病、卡波氏肉瘤等相关疱疹病毒感染，血流剪切力与动脉粥样硬化，JAK-STAT 信号通路、甲型流感等信号通路。上述结论表明，菊苣抗菌作用可通过多种生物途径、多条信号通路共同实现。

综上所述，本文在研究过程中以网络药理学方法为基础，分析菊苣中发挥抗菌作用的有效成分、靶点和信号通路，以期为后续菊苣抗菌活性研究活动的开展提供一定的理论基础和科学依据。