基于肉瘤基因信号通路探讨槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞的作用机制

潘小娟 史晓光 汪唐顺 陈振宙 左禧萌

(1 北京中医药大学,北京,100029; 2 北京中医药大学东直门医院,北京,100700)

乳腺癌已经成为全球女性新发癌症中发生率最高的癌症[1-2]。目前乳腺癌的治疗方法主要为手术、放化疗及靶向治疗等。化疗作为乳腺癌的主要治疗手段之一,不良反应主要为恶心呕吐、骨髓抑制及心脏毒性等[3],这些不良反应使抗肿瘤药物的临床应用难以达到满意的治疗预期,且随着化疗药物的应用,患者逐渐出现耐药[4],药物耐药性是肿瘤治疗中一个需要迫切解决的问题。中医药在临床中抗肿瘤治疗的效果得到了越来越多的认可,并且在临床治疗实践中发现其具有独特的临床优势。中药因其不良反应小等优势对于乳腺癌术后并发症及化疗不良反应有较好的疗效[5]。中药在乳腺癌治疗过程中发挥着不可替代的作用,寻找治疗效果好,不良反应小的中医药物质是现代医学的研究重点之一。槲皮素作为一种广泛存在的中草药黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抗炎症、抗菌和保护心血管的作用[6]。研究表明,大鼠肉瘤蛋白(Rat Sarcoma,Ras)-加速纤维肉瘤蛋白(Rapidly Accelerated Fibrosarcoma,Raf)-丝裂原激活的蛋白激酶(Mitogen-activatedProtein Kinase,MAPK)-细胞外信号调节激酶(Extracellular Signal Regulated Kinase,ERK)信号通路在乳癌细胞的增殖、凋亡及分化过程中具有重要作用。此外,RAS/RAF/MEK/ERK信号通路可以减少血管生成因子的分泌,抑制乳腺癌前病变血管生成[7]。虽然已有研究表明槲皮素可以抑制乳腺癌细胞的增殖[8],但关于槲皮素作用于RAS/RAF/MEK1信号通路的具体机制相关研究较少。本研究对槲皮素抑制乳腺癌MCF-7细胞作用机制进行研究,探讨其与RAS/RAF/MEK1信号通路的关系,为槲皮素应用于临床提供更多的实验支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 乳腺癌MCF-7细胞由中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心提供(资源编号:1101HUM-PUMC000013)。

1.1.2 药物 槲皮素购自北京索莱宝科技有限公司(批号:312C022,货号:SQ8030,纯度≥98%)。

1.1.3 试剂与仪器 N/H/K-Ras抗体(Proteintech,美国,货号:HX16148);MEK1抗体(Proteintech,美国,货号:11049-1-AP);YAP1抗体(Proteintech,美国,货号:10176-2-AP);ER抗体(Proteintech,美国,货号:21244-1-AP);PR抗体(Proteintech,美国,货号:25871-1-AP);GAPDH(Proteintech,美国,货号:10494-1-AP);山羊抗兔IgG(H&L)二抗Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)(Proteintech,美国,货号:SA00001-2);二甲基亚砜(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BS087);DMEM培养液(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL304A);10%胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司,货号:11011-8611);青霉素(100 U/mL)链霉素(100 mg/mL)溶液(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL505A);蛋白酶抑制剂cocktail(北京索莱宝科技有限公司,货号:P6730);Annexin V-FITC/PI(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL110B);胰蛋白酶消化液(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL527A);4%多聚甲醛(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL539A);0.1%曲拉通(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BS084-500ml);RIPA细胞裂解液(北京索莱宝科技有限公司,货号:R0100);PBS缓冲液(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL302A);DAPI溶液(北京兰杰柯科技有限公司,货号:BL105B)。细胞计数试剂检测试剂盒(北京兰杰柯科技有限公司,型号:BS350A);荧光显微镜(Leica公司,德国,型号:DM1000);酶标仪(赛默飞世尔科技有限公司,型号:51119180ET);流式细胞仪(贝克曼库尔特国际贸易有限公司,型号:CYTOMITS FC 500)。

1.2 方法

1.2.1 分组与模型制备

1.2.1.1 细胞培养 乳腺癌MCF-7细胞系经STR鉴定且无支原体,以DMEM培养液(Dulbecco′s modified Eagle Medium,DMEM)加入10%胎牛血清和青霉素(100 U/mL)链霉素(100 mg/mL)溶液进行配置,成为完全培养基后进行培养。培养条件为5%CO2,37 ℃的加湿培养箱。

1.2.1.2 槲皮素的制备 用二甲基亚砜(Dimethyl Sulfoxide,DMSO)充分溶解槲皮素,随机溶解为23.75 μmol/L、47.5 μmol/L、95 μmol/L、190 μmol/L,母液终浓度为190 μmol/L,用0.22 μm滤膜过滤2次,于4 ℃保存1周。1周内4 ℃保存。

1.2.1.3 分组 将培养的乳腺癌MCF-7细胞采用数字随机法分为空白对照组(0 μmol/L)、低剂量组(23.75 μmol/L)、中剂量组(47.5 μmol/L)、高剂量组(95 μmol/L)、极高剂量组(190 μmol/L)。

1.2.2 干预方法 空白对照组:乳腺癌MCF-7细胞培养基+0 μmol/L浓度的槲皮素培养基;低剂量组:乳腺癌MCF-7细胞培养基+23.75 μmol/L浓度的槲皮素培养基;中剂量组:乳腺癌MCF-7细胞培养基+47.5 μmol/L浓度的槲皮素培养基;高剂量组:乳腺癌MCF-7细胞培养基+95 μmol/L浓度的槲皮素培养基;极高剂量组:乳腺癌MCF-7细胞培养基+190 μmol/L浓度的槲皮素培养基。

1.2.3 检测指标与方法

1.2.3.1 细胞计数法(CCK-8)测定细胞活性 96孔板中种植MCF-7细胞,用DMEM高糖培养基培养24 h后,分别替换为含不同浓度槲皮素(0、23.75、47.5、95、190 μmol/L)的培养基继续在37 ℃、5%CO2、37 ℃条件下培养,分别在培养24 h、48 h和72 h后加入CCK-8试剂混匀,孵育1 h使用酶标仪在450 nm处测定吸光度(Absorbance,A)值。根据公式计算细胞生长抑制率:抑制率(%)=(对照组A值-观察组A值)/对照组A值×100%。

1.2.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡率 6孔板中种植密度为1.0×105MCF-7细胞/孔,贴壁后加入含不同浓度(23.75、47.5、95、190 μmol/L)槲皮素的培养基5 mL,培L养时间为48 h。然后用磷酸盐缓冲液(Phosphate-buffered Saline,PBS)洗涤3次,适量的加入胰蛋白酶进行消化,收集其细胞悬液,用1 000 r/min转速的离心机离心5 min,离心半径5.5 cm,弃其上清,再使用预冷的PBS重悬,离心后将细胞重悬于500 μL Binding Buffer(上样缓冲液);加入10 μL Annexin V-FITC(一种细胞凋亡检测试剂盒)以及5 μL碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)轻轻混匀,使用流式细胞仪检测凋亡率。

1.2.3.3 蛋白质印迹法检测RAS、MEK1、YAP的表达 25 mL培养瓶中种植密度为1.0×105MCF-7细胞/瓶,贴壁后加入含不同浓度(0、23.75、47.5、95、190 μmol/L)槲皮素培养基5 mL培养48 h。用PBS洗涤3次,加入适量胰蛋白酶消化,收集细胞悬液,用1 000 r/min转速的离心机离心5 min,离心半径5.5 cm,弃上清,使用预冷的PBS清洗3次,离心后收集细胞沉淀,用3 000 r/min转速的离心机离心5 min,离心半径8 cm,每组细胞沉淀加入含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA裂解液100 μL,在冰上裂解细胞30 min,手持式超声仪超声10 s。裂解后离心机离心收集上清,用12 000 r/min转速的离心机离心15 min,离心半径10 cm,BCA法蛋白定量后将蛋白浓度调至1.5 μg/μL,加5×loading buffer(上样缓冲液),沸水煮10 min。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V,1.5 h),转膜(206 mA,2.25 min),封闭1 h,4 ℃水平摇床一抗(N/H/K-Ras、Mek1、Yap1、GAPDH)孵育过夜。TBST缓冲液(Tris Buffered Saline with Tween-20,TBST)洗涤后加入二抗(1∶10 000)进行孵育,洗涤,然后用配制的增强化学发光(Enhanced Chemiluminescence,ECL)发光液与膜一起孵育30 s,用化学发光成像仪自动曝光,Image QuantTmlAS-4000Mini Imager摄片,ImageJ180分析量化条带灰度值,计算相对蛋白的含量。

1.2.3.4 免疫荧光染色及定量分析 12孔板中加入细胞爬片,种植密度为1.0×105MCF-7细胞/孔,贴壁后,加入含不同浓度(0、23.75、47.5、95、190 μmol/L)槲皮素的培养基培养48 h。4%多聚甲醛固定15 min,PBS溶液清洗3次。0.1%曲拉通-100于4 ℃条件下通透20 min,PBS清洗3三次。5%BSA封闭液封闭7 ℃孵育20 min,加一抗于4 ℃条件下孵育24 h,用PBS洗涤3次,加二抗后放37 ℃避光孵育30 min,PBS清洗3次,使用含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-Diamidino-2-phenylindole Dihydrochloride,DAPI)荧光淬灭封片剂封片,荧光显微镜下观察染色情况。摄片后ImageJ180进行平均荧光强度的分析。

2 结果

2.1 乳腺癌MCF-7细胞活力的比较 与空白对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组的乳腺癌MCF-7细胞活力均有下降,差异有统计学意义(P<0.01)。空白对照组在24 h、48 h、72 h的A值均高于低剂量组、中剂量组、高剂量组和极高剂量组,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的比较 与空白对照组比较,低剂量组、中剂量组、高剂量组、极高剂量组的乳腺癌MCF-7细胞晚期细胞凋亡率占比增加,差异有统计学意义(P<0.01)。见图1。空白对照组和低剂量组的细胞凋亡率相对接近(P>0.05),低剂量组、中剂量组、高剂量组和极高剂量组任意2组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。见表2。

表1 各组不同时间乳腺癌MCF-7细胞活力比较

图1 流式细胞仪检测各组乳腺癌MCF-7细胞凋亡的情况

表2 各组乳腺癌MCF-7细胞凋亡率的比较

2.3 乳腺癌MCF-7细胞MEK1、RAS、YAP蛋白表达比较 与空白对照组比较,中剂量组的MEK1、RAS、YAP蛋白的表达有一定降低,差异有统计学意义(P<0.05);极高剂量组的MEK1、RAS、YAP蛋白有更明显的降低,差异有统计学意义(P<0.01);此外,低剂量组的YAP蛋白表达有一定下调,差异有统计学意义(P<0.05)。见表3,图2。

2.4 乳腺癌MCF-7细胞中雌、孕激素受体表达比较 与空白对照组比较,中剂量组和极高剂量组的ER表达增加,差异有统计学意义(P<0.05);低剂量组、高剂量组的雌、孕激素受体表达和中剂量组、极高剂量组的孕激素受体表达均有显著增加,差异有统计学意义(P<0.01)。见表4,图3。

图2 各组乳腺癌MCF-7细胞YAP1、MEK1、RAS蛋白表达

3 讨论

槲皮素(3,3′,4′,5,7-五羟基黄酮)是最丰富的黄酮类化合物之一[9],既往研究发现槲皮素对许多不同类型的癌细胞有效[10],研究表明对前列腺癌、肝癌、肺癌、结肠癌和乳腺癌是最有效的[11]。冯亚莉等[12]认为槲皮素的抗癌活性可归因于与多种受体的相互作用,即死亡受体、生长因子受体和激素受体,以及抑制可能引发癌症的酶系统,参与修饰癌症发展的信号系统等。尽管槲皮素对许多癌症的抗癌作用已得到广泛认可,但关于槲皮素作用于RAS信号通路的作用机制研究较少。相关研究证明槲皮素通过调节细胞内的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)发挥抗癌作用,本实验主要研究的是槲皮素抗肿瘤相关机制,有研究表明槲皮素可调控口腔癌细胞中癌基因蛋白质p21-ras(Oncogene Protein p21-ras)的表达[13]。在本研究中,随着槲皮素浓度的上升,MEK1、RAS及YES关联蛋白重组蛋白(Recombinant Yes Associated Protein,YAP)的表达均出现不同程度的下降,其中MEK1、RAS均以190 μmol/L为最佳作用浓度,提示槲皮素对RAS-RAF信号通路中与肿瘤增殖相关的关键蛋白MEK1、RAS起到抑制作用。除此之外,随着槲皮素干预浓度的上升,乳腺癌MCF-7细胞的活性出现不同程度的下降,细胞凋亡出现不同程度的水平上升,这表明槲皮素对Ras信号通路的影响可能是进一步影响MCF-7细胞的活性并促进凋亡的原因。

表3 各组MEK1、RAS、YAP蛋白表达比较

表4 各组乳腺癌MCF-7细胞中雌、孕激素受体表达比较

图3 各组乳腺癌MCF-7细胞中ER、PR荧光染色(其中绿色为DyLight488,红色为DyLight594,×400)

RAS信号通路是经典信号通路之一,在调节细胞增殖、分化和存活方面起着核心作用[14]。Ras作为RAS信号通路上游关键信号分子之一,可以通过与二磷酸鸟苷(Guanosine-5′-diphosphate,GDP)(与GDP结合为失活状态)或三磷酸鸟苷(Guanosine Triphosphate,GTP)(与GTP结合为活化状态)结合发挥活性,参与肿瘤细胞的增殖、凋亡以及分化[15]。既往研究表明,RAS信号通路主要依靠各级激酶的磷酸化而激活,具体表现为Ras募集并激活Raf,Raf促进MEK1/2和ERK1/2的激活[16]。ERK的激活可磷酸化多数胞浆内和核内的靶基因,它们能够调控肿瘤细胞生长因子调节的基因表达,以此抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路,进而诱导肿瘤细胞的凋亡。此外,RAS/RAF/MEK/ERK信号通路还是多种血管生成信号通路的调节中心,通过协调多种促进或抑制血管生成的信号而决定新生血管的最终状态。乳腺癌是一种典型的血管依赖性肿瘤,其癌前病变的致癌机制与肿瘤血管生成密切相关[17]。研究表明RAS/RAF/MEK/ERK信号通路可以下调血管生成因子的分泌,从而抑制乳腺癌前病变的血管生成[18]。因此抑制Ras信号通路的转导或者降低Ras相关关键蛋白的表达水平可使Ras失活,从而抑制肿瘤细胞的增殖和癌前病变血管的生成[19]。

本研究中另一个研究靶点为Hippo信号通路中的经典蛋白YAP。Hippo信号通路为由一组保守的激酶构成,对细胞生长具有重要作用的信号通路,通过调控细胞生长影响组织大小,在癌症中,YAP的过表达影响下游因子转录增强相关结构域(Transcriptional Enhanced Associate Domain,TEAD)、肿瘤蛋白p73(Tumor Protein p73,p73)等一系列基因的表达,从而达到使肿瘤细胞增殖不受控制的目的。由于TEADs是EGFR-RAS-RAF-MAPK通路的中间体,是肿瘤中最重要的非受控分子通路之一,因此TEAD在表皮生长因子受体(Epidermal Growth Factor Receptor,EGFR)、肉瘤病毒癌基因(Kirsten Rat Sarcoma Viral Oncogene,KRAS)或B-Raf原癌基因-丝氨酸/苏氨酸激酶(B-Raf Proto-oncogene,Serine/Threonine Kinase,BRAF)瘤突变下游的抗药性和活动过度的进展中起着至关重要的作用[20]。与此同时,RAS和Ras-GTP酶之间的相互作用阻碍了YAP1核定位。这些简单的支架将不同RAS家族小G蛋白的活化与Hippo信号通路或p53调节联系起来[21]。因此,YAP尽管是Hippo信号通路中的重要靶点,其作用不仅仅是对Hippo信号通路的影响,Yap与Ras信号通路的相互作用仍旧是对肿瘤细胞增值甚至多重耐药造成影响的重要因素,值得关注[22-23]。

槲皮素经由调控Ras/MEK1途径的下游可能是PI3K/AKT信号通路,研究表明槲皮素可以通过槲皮素-3-甲基醚抑制PI3K/AKT信号通路抑制人乳腺癌干细胞的形成[24]。PI3K/AKT/mTOR信号通路是一个影响多种生理活动的广泛存在于体细胞中的信号通路。相关研究表明Raf1可以在MAPK/ERK和PI3K/AKT之间建立联系,使2种不同代谢途径之间可以进行相关反馈[25]。本实验结果显示,经不同浓度的槲皮素干预后,乳腺癌MCF-7细胞中MEK1及RAS蛋白的表达水平出现显著降低,当干预浓度达到190 μmol/L时效果最佳。该结果表明,槲皮素通过抑制Ras信号通路MEK1、RAS蛋白进而影响MCF-7细胞活性并促进其凋亡。并且,本研究中槲皮素是否通过Ras信号通路作用于PI3K/AKT信号通路,为之后槲皮素相关作用机制研究提供了一个新思路。

乳腺癌在世界范围内是发病率最高的恶性肿瘤[26],随着医学水平的逐步提高,乳腺癌的远期生存率得到明显升高,目前癌症治疗的主要困难是由于癌细胞逃避凋亡而对治疗产生耐药性[27],需要寻找新的药物克服耐药性。因此,寻找不良反应小的天然抗肿瘤药物成为大众研究的新目标。研究表明,天然植物及中药中含有的黄酮类化合物具有比较好的抗肿瘤作用[28],如野菊花总黄酮抑制MCF-7、MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭,诱导细胞凋亡[29];木犀草素可以激活p53信号通路、上调miR-34a-5p表达水平,进而抑制肺癌细胞增殖并促进其凋亡[30]。通过临床前研究表明,在癌症治疗的同时使用植物化学物质可以改善疾病预后,对癌症的化疗具有增强疗效的作用[31]。已有研究表明槲皮素可以增强MCF-7乳腺癌细胞对5-氟尿嘧啶的化学敏感性[32],槲皮素在本研究中可显著提高MCF-7细胞中雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)、孕激素受体(Progesterone Receptor,PR)表达,乳腺癌是激素依赖性肿瘤,表明槲皮素可以通过增加乳腺癌MCF-7细胞中ER、PR表达从而增加乳腺癌治疗敏感性,为提高临床癌症治疗效果及为临床化疗耐药寻找新的突破口提供实验理论支持。

综上所述,槲皮素对乳腺癌MCF-7细胞增殖具有抑制作用,并可促进其细胞凋亡,抑制作用随着药物浓度的增加而逐步增强,这和既往其他相关研究结果一致。本研究创新之处在于初步探索槲皮素作用于Ras信号通路对乳腺癌MCF-7的影响,结果表明,槲皮素可能通过抑制RAS/RAF/ERK信号通路关键蛋白MEK1、RAS进而降低MCF-7细胞活性,并促进其凋亡。同时为后续研究槲皮素通过Ras信号通路作用于PI3K/AKT信号通路提供新思路。此外,在本实验中槲皮素可以提高MCF-7细胞中ER、PR的表达水平,这为我们解决临床耐药、提高治疗效果提供了一个新的角度。本研究的不足之处在于缺少对于槲皮素现有应用的讨论,但相信随着现代医学分子研究的发展,槲皮素可以早日克服难溶于水、口服生物利用度低的缺点,更好更广泛地应用于临床。

利益冲突声明:无。