蓝靛果汁加工过程中褐变机理及防控技术

马永强 李 丹 杨晨曦 薛清卓 韩春然

(1. 黑龙江省谷物食品与谷物资源重点实验室,黑龙江 哈尔滨 150028;2. 哈尔滨商业大学食品工程学院,黑龙江 哈尔滨 150028)

蓝靛果(LoniceracaeruleaL.)属茜草目忍冬科忍冬属,常见名称有山茄子果、羊奶子等,是一种新兴的野生浆果[1]。果实呈细长椭圆形或圆柱形,颜色为蓝紫色,果皮通常涂有白色涂层,长度约2～3 cm、宽度约0.5～1 cm,果实重量约0.5～2.0 g,可直接食用,略苦涩[2]。具有较强的耐低温特性,果树能够在-40 ℃下生存而不受损坏,花朵能在-7 ℃下绽放,且不受土壤酸度变化及病虫害的影响,具有较强的适应能力[3]。蓝靛果中含有丰富的花色苷、黄酮、维生素C(VC)和矿物质等,具有较高的食用价值和药用价值[4]。其果汁在热杀菌过程中,由于温度较高,多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)已达到失活水平,因而主要发生的褐变为非酶促褐变。研究[4-5]表明,果汁在杀菌过程中发生的非酶促褐变反应主要为美拉德反应和VC氧化分解反应。5-羟甲基糠醛(5-HMF)是美拉德反应和VC氧化分解反应的中间产物,通常用其含量来衡量果汁的非酶促褐变程度。从杀菌过程中两种反应物比较来看,单糖作为美拉德反应的反应物,由于受到多糖分解的影响,其含量变化难以用来判断美拉德反应程度。因此,可将VC含量变化作为衡量VC氧化分解反应程度的标志物。

研究拟分析蓝靛果汁在热杀菌过程中褐变度、VC含量和5-HMF含量的变化,并基于这些变化确定蓝靛果汁在热杀菌过程中的非酶促褐变反应类型;同时运用动力学模型对褐变度、VC含量和5-HMF含量在热杀菌过程中的动态变化进行拟合分析,以期为提高蓝靛果产品品质提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

草酸、碳酸氢钠、亚甲蓝:分析纯,天津市致远化学试剂有限公司;

2,6-二氯酚靛酚:分析纯,上海蓝季科技发展有限公司;

亚铁氰化钾:分析纯,天津市恒兴化学试剂制造有限公司;

硫酸铜、酒石酸钾钠:分析纯,天津市化工三厂有限公司;

葡萄糖氧化酶:食品级,上海鑫泰实业有限公司;

美国惠普公司榨汁机:FL1963型,温州福菱科技有限公司;

紫外可见分光光度计:UV-5200型,上海元析仪器有限公司;

台式高速离心机:TD5A型,湖南凯达科学仪器有限公司;

高压蒸汽灭菌器:LDZX-50FBS型,上海申安医疗器械厂;

无菌工作台:SW-CJ-ECU型,苏州净化设备有限公司;

精密酸度计:PHS-2F型,上海雷磁仪电科学仪器有限公司;

高效液相色谱仪:1200型,美国Agilent公司;

电热恒温培养箱:DHP-9082型,上海百典设备有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 褐变度测定 称取蓝靛果汁,以水为空白,测定420 mm处吸光值[6]。

1.2.2 VC含量测定 采用2,6-二氯酚靛酚滴定法[7]。

1.2.3 5-HMF含量测定 参照牛丽影等[8]的方法并修改。称取1 mg 5-HMF标准品,用甲醇定容得100 mg/L标准液。分别吸取0.1,0.2,0.3,0.4,0.5 mL标准液于10 mL容量瓶中定容,即得1,2,3,4,5 mg/L的标准液,用0.45 μm微孔滤膜过滤。以浓度为横坐标,以峰面积为纵坐标,得标准曲线为y=89.042x+31.112,R2=0.999 5。取蓝靛果汁用超纯水稀释100倍,取10 mL蓝靛果汁与甲醇按V果汁∶V甲醇为1∶1溶解,6 000 r/min离心10 min,用0.45 μm微孔滤膜过滤,得待测样液。HPLC测定条件:色谱柱为ODS Lichrospher C18(150 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇—水(V甲醇∶V水为1∶9);柱温35 ℃;进样量20 μL;流速0.8 mL/min。

1.2.4 动力学模型拟合分析 采用零级、一级和联合反应动力学模型对杀菌过程中蓝靛果汁褐变度、VC含量及5-HMF含量的变化进行拟合分析。

零级反应:

C=C0+k0t,

(1)

一级反应:

C=C0exp(k1t),

(2)

联合反应:

(3)

式中:

C——任意时间指标测定值;

C0——该指标的起始值;

t——时间,min;

k0——零级动力学反应常数;

k1——一级动力学反应常数。

温度对褐变指数的影响符合阿内尼乌斯(Arrhenius)等式:

(4)

式中:

k——平衡常数;

k0——指数系数;

Ea——活化能,kJ/mol;

R——气体常数,8.314 kJ/(mol·K);

T——绝对温度,K。

两边同时取对数可得:

(5)

取353,363,373 K时模型的反应常数k值,以-lnk为纵坐标,1/T为横坐标,绘制曲线其斜率即为Ea/R,可求得Ea值。

1.2.5 非酶促褐变的控制

(1) 单因素试验:在葡萄糖氧化酶添加量为0.20%,30 ℃水浴45 min,并于80 ℃杀菌10 min下,分别考察葡萄糖氧化酶添加量(0.05%,0.10%,0.15%,0.20%,0.25%)、作用温度(10,20,30,40,50 ℃)及作用时间(15,30,45,60,75 min)对蓝靛果汁褐变抑制率的影响。

(2) 响应面试验:利用Box-Behnken进行响应面设计,以褐变抑制率为响应值,考察葡萄糖氧化酶添加量、作用温度及作用时间对蓝靛果汁褐变抑制效果的影响。

1.2.6 蓝靛果汁贮藏期间品质变化 经优化后蓝靛果汁加工过程为蓝靛果→酶促褐变复合抑制剂→打浆→过滤、离心→降酸→脱涩→过滤→葡萄糖氧化酶→杀菌→罐装。分别测定蓝靛果汁在4,25,37 ℃下贮藏30 d后微生物指标、理化指标和感官指标的变化。

(1) 微生物指标:参照GB 4789.2—2022。

(2) 总酸含量:采用pH计电位滴定法。

(3) 总酚含量:参照李雨浩等[9]的方法。

(4) 花色苷含量:采用pH示差法[10]。

(5) 还原糖含量:参照GB/T 5009.7—2016中直接滴定法。

(6)L*、a*、b*:采用色差仪测定,按式(6)计算总色差(ΔE)。

(6)

(7) 感官评定:感官评定小组共10人(男女各半),按表1从口感、香气、色泽及组织状态4个方面对蓝靛果汁进行感官评价。

表1 感官评价标准

1.2.7 数据分析 所有试验均平行3次,以平均值±标准差表示,使用SPSS 26.0软件进行显著性分析, 使用Design-Expert 13进行响应面设计,采用origin 2021绘图。

2 结果与分析

2.1 杀菌过程中非酶促褐变机理分析

2.1.1 褐变度、VC含量、5-HMF含量的变化 由图1(a)可知,随着杀菌温度和时间的增加,蓝靛果汁褐变度逐渐增加。80 ℃下加热50 min,果汁褐变度从0.292增加到0.502;90 ℃下加热50 min,果汁褐变度从0.292增加到0.552;100 ℃下加热50 min,果汁褐变度从0.292增加到0.724。结合表2可知,80 ℃下的相关系数均>0.98,90 ℃下零级和联合反应的相关系数较大,100 ℃下联合反应的相关系数大于零级反应的。整体来看,联合反应动力学模型能更好地拟合蓝靛果汁在3个杀菌温度下的褐变度变化。根据k值可知,温度越高,k值越大,褐变反应速率越快,褐变度越大,与Carabasa等[11]的研究结果一致。根据Arrhenius方程计算得到活化能为44.17 kJ/mol。通常认为反应活化能范围为40～400 kJ/mol,因此,当温度≥80 ℃时,蓝靛果汁易发生非酶促褐变反应。

图1 不同杀菌条件下蓝靛果汁褐变度、VC含量、5-HMF含量的变化

表2 不同杀菌条件下蓝靛果汁褐变度、VC含量、5-HMF含量的动力学参数

由图1(b)可知,随着杀菌时间的增加,蓝靛果汁中VC含量呈下降趋势,且杀菌温度越高,VC含量下降越明显。80 ℃下,果汁中VC损失12.74%;90 ℃下,果汁中VC损失17.56%;100 ℃下,果汁中VC损失23.16%。由表2可知,一级反应动力学模型对应的相关系数大于零级和联合反应动力学模型的,说明一级反应动力学模型能更好地拟合蓝靛果汁在3个杀菌温度下VC含量的变化。相应的反应常数k分别为-0.003,-0.004,-0.005,说明温度越高,VC降解速率越快,与曹少谦等[12]的研究结果一致。根据Arrhenius方程计算得到活化能为27.96 kJ/mol。当活化能<40 kJ/mol时,说明反应速率非常大[13]。因此,当温度≥80 ℃时,蓝靛果汁中的VC氧化分解反应很容易发生。

由图1(c)可知,果汁中5-HMF含量随杀菌温度和时间的增加逐渐增加,且温度越高增加的速度越快。当杀菌温度为80 ℃时,5-HMF增加了27.03%;当杀菌温度为90 ℃时,5-HMF增加了31.56%;当杀菌温度为100 ℃时,5-HMF增加了39.18%。由表2可知,零级反应动力学模型对应的相关系数大于一级和联合反应动力学模型的,说明零级反应动力学模型能更好地拟合蓝靛果汁在3个杀菌温度下5-HMF含量的变化,与Marisa等[14]的研究结果一致。相应的反应常数k分别为0.422,0.484,0.594,说明温度越高,5-HMF生成速率越快。根据Arrhenius方程计算得到5-HMF反应的活化能为18.66 kJ/mol。

2.1.2 蓝靛果杀菌过程中褐变度与5-HMF含量的线性关系 褐变度和5-HMF含量是果汁品质的两项重要指标,同时,5-HMF含量变化反映了果汁在加工过程中非酶褐变的程度。由表3可知,蓝靛果汁在80,90,100 ℃的杀菌过程中,褐变度与5-HMF含量的变化呈良好的线性关系,相关系数分别为0.987,0.986,0.992,且热处理温度越高,相关系数越接近1。因此,可以根据5-HMF含量的变化情况预测此温度下褐变度的变化。

表3 蓝靛果杀菌过程中褐变度与5-HMF的相关性

据报道[15],303 mg的VC会降解产生217 mg的5-HMF。蓝靛果汁在80,90,100 ℃下杀菌时,VC降解产生的5-HMF分别为6.67,9.19,12.12 mg/L,但5-HMF实际的生成量分别为19.46,22.72,28.21 mg/L。因此,VC降解产生的5-HMF与实际产生的5-HMF含量分别相差12.79,13.53,16.09 mg/L,可能是糖在酸催化条件下降解所致。因此,认为蓝靛果汁在杀菌过程中主要发生的是美拉德反应,其次是VC氧化分解反应。

2.2 单因素试验

由图2(a)可知,随着葡萄糖氧化酶添加量的增加,褐变抑制率先逐渐增加后趋于平稳。当葡萄糖氧化酶添加量为0.20%时,褐变抑制率逐渐趋于平稳,可能是因为蓝靛果汁中溶解的氧和葡萄糖几乎被耗尽,继续添加葡萄糖氧化酶对褐变度的影响不再明显[16]。考虑成本问题,选择最适的葡萄糖氧化酶添加量为0.20%。

图2 葡萄糖氧化酶、温度、时间对褐变抑制率的影响

由图2(b)可知,随着作用温度的增加,褐变抑制率先增加后降低,当作用温度为40 ℃时,褐变抑制率最高为72.28%。当作用温度>40 ℃时,褐变抑制率降低,主要是因为随着作用温度的升高,葡萄糖氧化酶活性逐渐降低[17]。温度过高或过低均不利于葡萄糖氧化酶发挥抑制褐变的作用,因此选择最适的作用温度为40 ℃。

由图2(c)可知,随着作用时间的增加,褐变抑制率先增加后降低,当作用时间为45 min时,褐变抑制率最高,为72.28%。随着作用时间的增加,褐变抑制率反而降低,可能是因为作用45 min时,蓝靛果汁中的溶解氧和葡萄糖已被葡萄糖氧化酶充分除去,继续延长作用时间,蓝靛果汁中溶解的氧和葡萄糖含量甚微,且增加了果汁在40 ℃下作用的时间,导致时间超过45 min时褐变度会略微增加[18],褐变抑制率降低。因此,选择最适的作用时间为45 min。

2.3 响应面试验

2.3.1 响应面试验设计及结果 以单因素试验为基础,考察葡萄糖氧化酶添加量、作用温度、作用时间3个因素及各因素之间的交互作用对蓝靛果汁褐变抑制率的影响,确定葡萄糖氧化酶最佳处理条件。试验因素水平见表4,试验设计及结果见表5。

表4 褐变抑制试验设计因素水平表

表5 响应面试验设计及结果

2.3.2 回归模型的建立及显著性分析 采用Design-Expert 13.0软件对试验数据进行拟合分析,得到蓝靛果汁褐变抑制率的二次多项回归方程为:

Y=72.26+0.793 8A-0.848 7B-0.112 5C-0.215AB-0.157 5AC+0.442 5BC-2.66A2-3.02B2-2.00C2。

(7)

由表6可知,模型P<0.000 1(极显著),失拟项P=0.133 3>0.05(不显著),方程拟合度和相关性较好,误差较小,模型合理。总决定系数为0.999 2,精确可信;校正系数为0.998 2,说明预测值与实际值高度一致,可采用该模型预测未知条件下葡萄糖氧化酶添加量、作用温度及作用时间对果汁非酶褐变抑制率的影响。根据F值可知,影响蓝靛果汁褐变抑制率的因素顺序为作用时间<葡萄糖氧化酶添加量<作用温度。一次项A、B,交互项AB、BC,二次项A2、B2和C2均极显著(P<0.01),一次项C、交互项AC为显著水平(P<0.05)。

表6 回归模型方差分析†

2.3.3 各因素交互作用分析 如图3所示,各因素的交互作用均显著,与表6结果一致。

图3 各因素交互作用的响应面

2.3.4 工艺验证 根据软件对数据进行响应面结果分析,预测蓝靛果汁最优非酶促褐变抑制工艺条件为葡萄糖氧化酶添加量0.207 8%、作用温度39.25 ℃、作用时间44.74 min,此条件下预测果汁褐变抑制率为95.13%。考虑实际可操作性,选取葡萄糖氧化酶添加量为0.21%、作用温度为39 ℃、作用时间为45 min,该条件下得到的蓝靛果汁褐变抑制率为95.03%(n=3),与理论预测值基本一致,说明所建模型有效可行,可以对蓝靛果汁非酶促褐变抑制剂进行优化、分析和预测。

2.4 蓝靛果汁贮藏期间品质变化

2.4.1 微生物指标变化 蓝靛果汁经杀菌处理后,于4,25,37 ℃下贮藏30 d过程中,菌落总数均未超过100 CFU/mL,符合GB 7101—2022中微生物限量要求。

2.4.2 理化指标变化 由图4(a)可知,果汁褐变度随贮藏时间的增加而增加,且贮藏温度越高,褐变度增加越快。4,25 ℃下贮藏30 d时,果汁褐变度分别为0.216,0.247;37 ℃下贮藏20 d时,果汁褐变度为0.231,贮藏30 d时,果汁褐变度为0.289,褐变明显,肉眼可见。因此,4 ℃下贮藏更有利于减少果汁的褐变反应,提高果汁在贮藏期间的品质。

图4 蓝靛果汁贮藏期间理化指标及色泽的变化

由图4(b)可知,蓝靛果汁中可溶性固形物含量在贮藏前5 d下降较快。此后随着贮藏时间的增加,含量下降较缓慢。4 ℃下贮藏时可溶性固形物含量变化范围为14.15%～15.00%;25 ℃时为14.06%～15.00%;37 ℃时为14.01%～15.00%。直至贮藏终点,蓝靛果汁中可溶性固形物含量为4 ℃>25 ℃>37 ℃,但均保持在14.00%以上的较高水平,表明3个温度下贮藏30 d,果汁中可溶性固形物的稳定性较好,可能是因为杀菌过程中将果汁中与水解有关的酶钝化,使得可溶性固形物的含量波动范围较小[19]。

由图4(c)可知,随着贮藏时间的延长,果汁中总酸含量呈上升趋势。贮藏初始,总酸含量为6.08 g/L,4 ℃下贮藏至结束时总酸含量为6.19 g/L,整体变化不明显;25,37 ℃下贮藏至结束时总酸含量分别为6.31,6.39 g/L,含量变化主要体现在贮藏后期。整体来看,3个贮藏条件下总酸含量变化范围较小,说明蓝靛果汁在贮藏过程中总酸处于相对稳定状态。

由图4(d)可知,随着贮藏时间的延长,蓝靛果汁中总酚含量逐渐下降,且温度越高总酚含量下降越明显。4,25,37 ℃下贮藏至结束,蓝靛果汁中总酚含量分别由463.09 g/100 g降至262.02,245.35,207.58 g/100 g。3个贮藏条件下,蓝靛果汁中总酚含量下降均显著,但相对来说4 ℃更有利于总酚的保留。总酚含量逐渐降低可能是果汁中溶解的氧在贮藏期间形成了氧自由基,导致酚类物质发生自身氧化,或与蛋白质发生了聚合反应[20]。

由图4(e)可知,随着贮藏时间的延长,蓝靛果汁中花色苷含量逐渐减少。贮藏初始,蓝靛果汁中花色苷含量为471.34 mg/L;贮藏第30天,4,25,37 ℃下的花色苷含量分别为380.50,277.64,142.04 mg/L,均明显降低,且贮藏温度越高,花色苷含量下降越明显,主要是因为花色苷在温度较高的条件下不稳定,易分解所致。整体来看,4 ℃的贮藏条件对于蓝靛果汁中花色苷含量的保留更加有利。

由图4(f)可知,蓝靛果汁中VC含量随贮藏时间的延长呈下降趋势。贮藏初始,蓝靛果汁中VC含量为70.84 mg/L。4 ℃下贮藏30 d后,蓝靛果汁中VC含量为65.37 mg/L,变化不明显;25 ℃下贮藏第20天,蓝靛果汁中VC含量为64.91 mg/L,低于4 ℃下贮藏30 d的,贮藏第30天,VC含量为61.73 mg/L;37 ℃下贮藏第15、30天,VC含量分别为63.78, 55.26 mg/L,说明37 ℃下贮藏VC含量下降较明显。这主要是因为温度越高,VC越容易发生氧化分解,导致其含量不断减少[21]。因此,4 ℃下贮藏更有利于保留蓝靛果汁中的营养成分。

由图4(g)可知,蓝靛果汁中还原糖含量随贮藏时间的延长逐渐减少。贮藏初始,蓝靛果汁中还原糖含量为10.18 g/100 g。4 ℃下,还原糖含量变化不明显,直至贮藏结束时还原糖含量为9.62 g/100 g;25,37 ℃下贮藏,前期还原糖下降速度较快,后期下降速度缓慢,直至贮藏结束还原糖含量分别为7.93,6.24 g/100 g。初期还原糖下降速度较快主要是因为发生了美拉德反应[22],后期还原糖下降速度缓慢可能是因为蓝靛果汁中的蔗糖分解成了葡萄糖和果糖,弥补了美拉德反应过程中损失的还原糖[23]。

由图4(h)～图4(g)可知,贮藏期间,蓝靛果汁的L*和b*值呈下降趋势,说明果汁在贮藏过程中存在褐变现象使颜色变暗;a*值呈上升趋势,说明果汁在贮藏过程中红色色调加深,与Bulut等[24]的研究结果一致。但Chen等[25]研究发现,贮藏过程中荔枝的L*、a*、b*值均呈下降趋势。贮藏过程中,蓝靛果汁的a*值呈上升趋势可能是因为蓝靛果中含有高含量的花色苷,花色苷会随果汁体系酸碱度的变化而改变,通常在酸性环境下的颜色更趋近红色[26],与总酸含量的变化规律相符。

由图4(k)可知,ΔE随贮藏时间的增加逐渐增大,且温度越高ΔE变化越明显。4 ℃下贮藏第5天,蓝靛果汁的ΔE为0.38<0.5,说明此时颜色变化不明显,直至贮藏结束时ΔE为2.37,颜色变化明显;25,37 ℃下贮藏时,果汁颜色在初期就有明显变化,直至贮藏结束时ΔE分别为3.67和5.43,此时果汁颜色的变化通过肉眼清晰可见。总体来看,4 ℃更有利于延缓蓝靛果汁在贮藏过程中颜色的改变。

2.4.3 感官指标 在对蓝靛果汁进行感官评价时认为,感官评分<60分则不被大众接受。由图5可知,蓝靛果汁感官评分随贮藏时间的延长呈下降趋势,且不同温度之间存在显著差异(P<0.05)。4 ℃下直至贮藏结束,蓝靛果汁感官评分仍处于较高得分(82.3分),此时保留着果汁本身特有的果味及果香,且颜色均一、质地均匀;25 ℃下贮藏30 d时,感官评分为74.3分,此时果汁口感略酸、果香较淡、颜色变暗,但质地均匀、无沉淀,能被大众接受;37 ℃下贮藏20 d时感官评分为63.0分,此时果汁能被大众接受,贮藏30 d时感官评分为48.7分,此时果汁口感过酸、略有异味、颜色变暗、底部略有沉淀,不被大众接受。因此,4 ℃下贮藏更有利于保持蓝靛果汁的品质。

图5 蓝靛果汁贮藏期间感官评分的变化

3 结论

研究了蓝靛果在杀菌过程中非酶促褐变机理、非酶促褐变的抑制及贮藏品质。结果表明,果汁褐变度的变化符合联合反应动力学模型,反应活化能为44.17 kJ/mol;维生素C含量变化符合一级反应动力学模型,反应活化能为27.96 kJ/mol;5-羟甲基糠醛含量变化符合零级反应动力学模型,反应活化能为18.66 kJ/mol,说明可根据5-羟甲基糠醛含量的变化预测果汁非酶促褐变程度。蓝靛果汁褐变抑制效果的最优处理条件为葡萄糖氧化酶添加量0.21%、作用温度39 ℃、作用时间45 min,该条件下蓝靛果汁的褐变抑制率为95.03%。4 ℃下贮藏的果汁品质变化相对迟缓,其活性成分保留率高,且具有蓝靛果的果香与果味、颜色均一、质地均匀。后续将对蓝靛果汁的贮藏进行更深入的研究。