表没食子儿茶素没食子酸酯通过抑制NLRP3炎症小体改善溃疡性结肠炎小鼠肠道屏障的研究

张 敏 张 晟 周 华

安徽医学高等专科学校生理教研室 安徽 合肥 230601

炎症性肠病是一种慢性、复发性、炎症性肠道疾病,主要包括两种类型:溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC) 和克罗恩病(Crohn′s disease,CD)[1]。在临床上,UC的发病率普遍高于CD,尤其在北美和欧洲等西方发达国家。然而近年来随着饮食结构的改变,UC在我国的发病率不断上升[2]。UC的典型特征是腹痛、腹泻、粪便带粘液或脓血,病程较长,最终会导致严重的并发症,如血栓形成、穿孔和结直肠癌,极大地影响了患者的正常生活[3]。因此,UC已成为亟待解决的公共健康问题之一。

UC具有复杂的多因素发病机制,包括免疫反应失调、遗传易感性、环境因素和微生物因素,其确切发病机制尚未完全阐明[4]。目前,UC的主要治疗手段是手术和药物治疗,常见的药物为氨基水杨酸类、类固醇类和免疫抑制药物等。这些治疗药物长期服用会产生严重的副作用。因此,寻找低毒且高效地改善UC的天然化合物并探索其作用机制已成为当前研究的热点。

绿茶作为一种健康饮品,是由山茶科植物芽叶加工制成的,具有抗炎、抗癌等作用。茶叶中富含茶多酚类物质,其中起主要作用的活性成分是表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate,EGCG)。研究发现EGCG具有低毒性和多种生物活性,包括抗氧化、抗肿瘤、抗炎和增强机体免疫功能等[5-6]。有文献报道,EGCG对UC小鼠具有一定的保护作用[7],但是其具体机制尚不明确。因此,在建立UC小鼠模型的基础上,通过灌胃给予EGCG干预治疗,观察EGCG对UC小鼠肠道粘膜屏障的保护作用并探讨其机制。

1 材料与方法

1.1 材料 雄性C57BL/6J小鼠32只购于安徽医科大学实验动物中心,体质量为20～24 g,自由饮食、饮水。分子量36～50 kDa的葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium,DSS)购自MP Biomedicals公司,EGCG购自上海麦克林生化科技股份有限公司;小鼠血清IL-1β、IL-6和IL-10酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测试剂盒(武汉华美生物有限公司);苏木素-伊红(hematoxylin and eosin,HE)染色试剂盒(上海碧云天生物有限公司);总RNA提取试剂盒购自北京索莱宝生物公司;FastKing一步法反转录荧光定量试剂盒购自北京天根生物公司,引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;兔抗小鼠核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3,NLRP3)一抗抗体、兔抗小鼠caspase-1(p20)一抗抗体和山羊抗兔二抗抗体购自武汉博士德生物有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及模型建立 所有小鼠适应性饲养1周后,随机分为正常(CON)组、模型(DSS)组、模型+低剂量EGCG(LEG)组和模型+高剂量EGCG(HEG)组,每组8只。给予3组模型小鼠含有3%DSS的饮用水,正常组小鼠正常饮水,连续7 d,建立UC小鼠模型。从造模第1天开始,LEG组和HEG组分别给予50、100 mg/kg EGCG灌胃,CON组和DSS组给予生理盐水灌胃,每天1次,连续7 d。

1.2.2 疾病活动指数(disease activity index,DAI)评价 每天观察小鼠的体质量变化、大便性状和便血情况等,根据文献[8],计算小鼠的DAI值。DAI评分细则为:①体质量减轻(0分=无;1分=减轻1%～5%;2分=减轻5%～10%;3分=减轻10%～15%;4分=减轻超过15%);②腹泻(0分=正常,2分=稀便,4分=水样腹泻);③便血(0分=无出血,2分=轻微出血,4分=大出血)。最终DAI分值=(体质量减轻分值+腹泻情况分值+便血情况分值)/3。实验结束后,将小鼠用异氟烷麻醉后,摘眼球取血,收集血清。开腹取小鼠的结肠组织,量取结肠的长度。用冰冷的生理盐水浸洗后,部分结肠组织置于4%多聚甲醛溶液中固定,剩下的结肠组织置于-70℃用于后续实验。

1.2.3 检测血清IL-1β、IL-6和IL-10水平 取各组小鼠血清,按ELISA试剂盒说明书方法检测IL-1β、IL-6和IL-10水平。

1.2.4 结肠组织病理学检测 结肠组织经多聚甲醛溶液固定后,脱水、石蜡包埋后,切成5 μm的薄片,进行HE染色,中性树胶封片后观察。

1.2.5 RT-qPCR检测 提取结肠组织总RNA,利用试剂盒扩增闭锁小带蛋白1(zonulaoccludens-1,ZO-1)和闭合蛋白(occludin)基因。反应条件:50℃ 30 min 逆转录,95℃ 3 min预变性,以95℃ 15 s,60℃ 40 s,反应40个循环,以GAPDH作为内参,按2-ΔΔCt计算相对表达量。引物序列如下。ZO-1上游引物:5′-CGG GCT ACC TTA CTG AAC GTC C-3′,下游引物:5′-GAG CGA CCT GAA TGG TCT GAT G-3′。occludin上游引物:5′-AGT CCA CCT CCT TAC AGA CCT-3′,下游引物:5′-CTG TCC CAA GCA AGT GTG GA-3′。GAPDH上游引物:5′-CTG CGA CTT CAA CAG CAA CT-3′,下游引物:5′-GAG TTG GGA TAG GGC CTC TC-3′。

1.2.6 Western blot法 取50 mg小鼠结肠组织,提取蛋白后测蛋白浓度。取50 μg上样,蛋白经SDS-PAGE电泳后,电转至PVDF膜上。将带有目的蛋白的PVDF膜放入含5%脱脂奶粉的TBST缓冲液中,在室温下封闭2 h,再分别加入1∶1 000稀释的兔抗小鼠NLRP3和caspase-1一抗抗体,1∶2 000稀释的兔抗小鼠GAPDH一抗抗体,4℃孵育过夜。次日用TBST洗膜3次后,加入1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体,室温孵育1 h。洗膜后,ECL显影,曝光成像后测定条带的灰度值,分别计算NLRP3蛋白和caspase-1蛋白与GAPDH蛋白的相对表达水平。

2 结果

2.1 各组小鼠DAI评分 CON组小鼠体质量、毛发和大便情况等体征无明显异常。与CON组比较,DSS组小鼠体质量下降、毛发无光泽、腹泻、粪便带血,小鼠DAI评分明显增高(P<0.01)。与DSS组比较,LEG和HEG组小鼠体质量、毛发和大便情况均明显改善,DAI评分均明显下降(P<0.05,P<0.01,见图1)。

与CON组比较,**P<0.01;与DSS组比较,#P<0.05,##P<0.01。

2.2 小鼠血清IL-1β、IL-6和IL-10水平 与CON组比较,DSS组小鼠血清中IL-1β和IL-6浓度显著升高(P<0.01),IL-10浓度显著下降(P<0.01);DSS组相比,LEG和HEG组小鼠血清中IL-1β和IL-6浓度明显降低(P<0.05,P<0.01),IL-10浓度明显增高(P<0.01,见表1)。

表1 EGCG对UC小鼠血清IL-1β、IL-6和IL-10水平的影响

2.3 各组小鼠结肠长度 与CON组比较,DSS组小鼠结肠长度显著降低(P<0.01);与DSS组比较,LEG和HEG组中小鼠结肠长度均有所提高(P<0.05,P<0.01),见图2。这表明,EGCG干预对UC小鼠结肠长度的缩短具有一定的抑制作用。

与CON组比较,**P<0.01;与DSS组比较,#P<0.05,##P<0.01。

2.4 结肠组织病理结构变化 CON组小鼠的结肠组织结构表现正常,隐窝明显,含有大量的杯状细胞,炎性细胞浸润较少。与CON组比较,DSS组小鼠结肠上皮组织损伤严重,隐窝结构大大减少,出现大量炎性细胞浸润。与DSS组比较,给予不同剂量EGCG治疗后,小鼠结肠组织结构均得到了一定程度的改善,炎性细胞浸润明显减少,隐窝结构明显恢复。这表明,EGCG对UC小鼠的结肠组织具有较好的保护作用,且在高剂量EGCG时效果较明显。见图3。

图3 各组小鼠结肠组织病理学变化

2.5 结肠组织ZO-1和occludin mRNA表达水平测定 与CON组比较,DSS组ZO-1和occludin的mRNA表达明显降低(P<0.01)。与DSS组比较,LEG和HEG组中ZO-1和occludin mRNA表达明显增加(P<0.05,P<0.01,见图4)。这表明,EGCG可以改善UC小鼠结肠组织的紧密连接蛋白表达,增强肠道的屏障功能。

A.ZO-1;B.occludin。与CON组比较,**P<0.01;与DSS组比较,#P<0.05,##P<0.01。

2.6 结肠组织NLRP3和caspase-1蛋白表达测定 与CON组比较,DSS组NLRP3和活化的caspase-1蛋白表达明显增高(P<0.01),表明UC小鼠结肠组织中NLRP3炎症小体活化,加重了炎症反应。与DSS组相比,LEG和HEG组中NLRP3和活化的caspase-1蛋白表达均明显下降(P<0.05,P<0.01,见图5)。这表明,EGCG可抑制结肠组织NLRP3炎症小体的活化,抑制结肠的炎症反应。

A.Western blot结果;B.NLRP3相对表达量;C.caspase-1相对表达量。与CON组比较,**P<0.01;与DSS组比较,#P<0.05,##P<0.01。

3 讨论

用DSS建立的UC模型是最常用的模型之一,因为其操作简单,且症状多类似于人类结肠炎[9]。其已知的病理变化包括溃疡、隐窝脓肿、杯状细胞减少和炎症细胞浸润。在本实验中,给予小鼠含3%DSS的饮用水7 d,以诱导实验性结肠炎。从建模的第5天开始,观察到模型组小鼠出现了结肠炎的典型症状,如体重明显减轻、毛发不顺、腹泻、便血粘稠,甚至肛门出血。造模结束后解剖发现,DSS组小鼠结肠明显缩短,结肠组织充血、水肿。HE染色显示DSS组小鼠结肠隐窝结构消失,杯状细胞减少,炎细胞浸润严重。这表明,已成功建立UC小鼠模型。

EGCG是绿茶中最丰富的儿茶素之一,对各种组织和细胞均表现出较强的抗氧化、抗炎和抗凋亡活性[10]。Xu等[11]研究发现,EGCG可通过降低实验性结肠炎小鼠模型中的IL-6的水平来调节Treg/Th17的平衡,改善UC症状。葛思堂等[12]研究发现EGCG可通过抑制JAK2/STAT3炎症信号通路进而改善三硝基苯磺酸诱导的结肠炎小鼠的肠道屏障功能。Yeoh B S等[13]研究发现EGCG在治疗肠道炎症方面的有益作用,富含EGCG的饮食可抑制结肠组织产生NADPH氧化酶,清除活性氧,减少氧化应激,并抑制髓过氧化物酶,保护肠道免受炎症损害。本研究显示,给予高、低剂量EGCG干预后,小鼠的体重减轻有所抑制,腹泻和粪便状态有所好转,DAI值降低,结肠的长度缩短和病理损伤明显改善,进一步证实EGCG对UC小鼠具有较好的保护作用。

结肠的上皮细胞受到黏液的保护,形成黏膜屏障,防止细菌直接接触结肠组织;一旦黏液屏障受损,即会引起炎症[14]。这种保护性黏液主要是由隐窝中的杯状细胞合成和分泌的。此外,紧密连接是上皮细胞之间最紧密的粘附方式,构成物理屏障,离子和小分子溶质可以选择性地穿过细胞间隙[15]。必需的紧密连接蛋白主要包括跨膜蛋白(occludin)和细胞骨架连接蛋白(ZO)。紧密连接蛋白表达的变化会影响肠道通透性,进而影响肠道炎症状态[16]。本研究表明,与正常小鼠相比,模型组小鼠结肠中杯状细胞的数量和紧密连接蛋白的表达明显降低,导致结肠的屏障功能受损。一旦结肠屏障功能受损,肠道的通透性增加,有害细菌和过量的细菌代谢产物,如脂多糖等进入结肠组织引起炎症。EGCG干预后,杯状细胞的数目以及结肠组织中紧密连接蛋白的表达水平得到改善,表明EGCG可以改善结肠屏障,抑制致病因子进入结肠组织。

此外,UC的发生和发展进程与炎症反应密切相关[17]。先天免疫系统是大多数生物体对疾病或损伤作出快速反应的主要机制。模式识别受体(pattern-recognition receptors,PRRs)被宿主激活,并识别由感染或受损细胞释放的化学物质。多蛋白复合物NLRP3炎症小体是一种PRRs,对宿主先天防御细菌、真菌和病毒感染至关重要。NLRP3炎症小体的失调与许多炎症相关疾病相关。炎症小体的激活最终导致caspase-1的产生,这是炎症适应性免疫细胞反应的主要介质,pro-IL-1β和pro-IL-18被活化的caspase-1切割为其生物活性形式,进一步加重组织损伤[18]。在本实验中,UC小鼠血清中的促炎因子含量明显增加、抗炎因子浓度明显下降,且结肠组织NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平显著高于正常小鼠,表明UC小鼠结肠组织中的炎症反应加剧。本研究给予低剂量和高剂量EGCG后,小鼠血清中促炎细胞因子含量明显降低、抗炎因子的浓度明显增加,结肠组织中NLRP3炎症小体相关蛋白的表达水平明显下降。这表明,EGCG对UC小鼠结肠组织中NLRP3炎症小体介导的炎症反应具有较好的抑制作用,且在高剂量EGCG组中效果较为明显。

综上所述,EGCG可明显改善UC小鼠的症状和炎症反应,减轻小鼠的结肠屏障损伤,其机制可能与抑制结肠组织NLRP3炎症小体的活化相关。