猪胸膜肺炎放线杆菌新疆株分离鉴定及生物学特性研究

张雪丽,张金江,王宏图,冷婧,赵颖婕,胡建军,敖维平*

(1 塔里木大学生命科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)(2 阿图什市动物卫生监督所,新疆 阿图什 845350)(3 塔里木大学动物科学与技术学院,新疆 阿拉尔 843300)

猪传染性胸膜肺炎(porcine contagious pleuropneumonia,PCP)又称为猪接触传染性胸膜肺炎,是一种能引起猪高度接触性的呼吸道传染病,其病原为猪胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae,APP),旧称胸膜肺炎嗜血杆菌(haemophiluspleuropneumoniae)或副溶血嗜血杆菌(H.parahaemolyticus)。该病主要表现为高度传染性、致死性,已成为危害养猪业健康发展的重要疫病之一[1-2]。世界各养猪国家均有此病的报道,我国于1987年首次在国内发现本病存在。

根据APP在培养基上生长是否依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD),可将其分为生物Ⅰ型(NAD依赖型)、生物Ⅱ型(非NAD依赖型)2种生物型。其中,生物Ⅰ型具有极强的溶血活性和细胞毒性,毒力强,危害大;与金黄色葡萄球菌一起培养时,可为其提供必需的生长因子。根据荚膜多糖、LPS的抗原差异性,APP可分为19个血清型[3-4],不同血清型菌株的毒力存在差异,其中1、5、9及11型毒力最强,3、6型毒力弱[5]。APP血清型1型是最近频繁报道的血清型,毒力强,危害大。

国内多位学者报道了APP血清型及其流行情况,APP血清型主要包括1、2、3、4、5、7、8、9、10型,但不同地域血清型可能存在差异,血清型的感染率也存在差异[6-7]。2007年,韩文星等[8]从新疆某猪场分离到APP并进行了部分生物学特性研究,但未确定APP血清型。2012年,王忠山等[9]在新疆北疆某垦区64个规模猪场进行了部分猪疫病血清学调查,发现APP存在与其他疫病混合感染且感染率高的情况。2019年,郑培等[10]在新疆昌吉市和奇台县规模化猪场分离得到APP血清型5型菌株,该菌株已成为新疆流行的优势菌株。在国外,STRINGER O W 等[3]通过APP血清型19型特异性引物对来自不同地区的病猪进行了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌鉴定,其中来自丹麦的菌株7213384-1猪传染性胸膜肺炎放线杆菌被建议作为血清型19型的参考株。

目前,世界上不同国家及地区APP流行菌株的血清型、生物型、流行率不尽一致,同时各血清型间交叉保护力弱[2]。另外,APP对抗菌药出现耐药性或多重耐药性的现象,给该病的预防、治疗、净化等带来了一定的难度。因此,对APP进行细菌分离鉴定、血清型分型、药敏试验等尤为必要。新疆南疆某规模猪场疑似爆发APP,为减少养殖场的经济损失,本试验通过临床剖检、病理观察、细菌分离培养、生化试验、PCR鉴定以及药敏试验和动物致病性试验来确定该疾病病原、血清型及耐药性,为PCP的防治、疫苗选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 样品来源

2021年9月中旬,新疆南疆某规模猪场3 d内连续死亡10头体重约50 kg的4～5月龄育肥猪,病程短,病猪体温升高。病理观察见胸腔有明显的纤维素渗出,肺与胸膜粘连,肺脏肿大、变性、出血、淤血,耳朵发绀,口鼻流涎带有血丝。经兽医流行病学调查得知该猪场有引进后备种猪的记录史,初诊为疑似猪传染性胸膜肺炎。无菌操作采集发病死亡猪的肺脏、淋巴结等组织病料,低温保存并进行实验室检测。

1.1.2 主要试剂

胰酪胨大豆琼脂培养基(TSA-YE)、胰蛋白胨大豆酵母肉汤培养基(TSB-YE)、细菌微量生化反应管均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)购自北京索莱宝科技有限公司;BHI培养基购自北京奥博星生物技术有限责任公司;抗生素药敏试验纸片购自杭州微生物试剂有限公司;2×Taq PCR MasterMix、DL-2 000 Marker购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.1.3 引物

apxI、apxⅡ、apxⅢ、apxIV基因特异性引物、血清型分型引物借鉴文献[3-4,11-14](如表1、表2所示),所有引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

表1 APP apx基因特异性引物

表2 APP血清型PCR鉴定引物

1.2 试验方法

1.2.1 细菌分离

无菌采取病料接种于含10 μg/mL NAD的TSA-YE琼脂培养基和不含NAD的TSA-YE琼脂培养基、巧克力琼脂培养基、绵羊血琼脂培养基,37 ℃培养24～48 h。观察划线细菌生长状况及菌落形态,挑取疑似菌落进行革兰氏染色镜检,观察其形态特征。挑取单菌落接种于BHI液体培养基中培养16～18 h,观察细菌生长状况。

1.2.2 NAD依赖试验

挑取单菌落分别划线接种于NAD阳性(10 μg/mL NAD,5%牛血清)、NAD阴性(不含有NAD,5%牛血清)的TSA-YE琼脂培养基。置于37 ℃恒温培养箱培养18～24 h,观察菌落生长情况。

1.2.3 “卫星”现象试验

将分离株在含5%新鲜绵羊血的TSA-YE琼脂培养基上连续划线,再用金黄色葡萄球菌划一直线,垂直(不相交)于金黄色葡萄球菌划线接种分离的APP,37 ℃培养18～24 h。

1.2.4 CAMP 试验

用金黄色葡萄球菌在含5%新鲜绵羊血的TSA-YE培养基上划一横线,在此横线下方约0.3～0.5 cm处,用NAD阳性APP分离菌株垂直划线接种,但不接触横线,37 ℃培养18～24 h。

1.2.5 生化试验

挑取分离株纯培养物接种于细菌微量生化反应管,37 ℃培养18～24 h。明胶生化反应若在18～24 h为阴性,可继续培养18～24 h,转冰箱2～8 ℃培养30 min,观察结果。

1.2.6 APP分离株PCR鉴定

分离菌株经apxIV特异性引物(见表1)进行PCR扩增,PCR反应体系(25 μL)为2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,10 μmol/L上下游引物各1 μL,模板1 μL,ddH2O补充至25 μL。PCR反应条件为94 ℃ 4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30个循环;72 ℃ 10 min。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,回收阳性PCR产物,送上海赛恒生物科技有限公司测序。

1.2.7 APP血清型分型PCR鉴定

根据APP种的PCR鉴定结果,以APP血清型分型引物(表2)进行PCR鉴定,1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物,回收阳性PCR产物,送上海赛恒生物科技有限公司测序。

1.2.8apx毒力基因PCR鉴定

以apx毒力基因特异性引物(见表1)进行PCR检测,PCR反应体系为25 μL,PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,共30个循环;72 ℃ 10 min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,回收阳性PCR产物,送上海赛恒生物科技有限公司测序。

1.2.9floR耐药基因PCR检测

floR耐药基因引物[15]floR-F:5′-CGACGCCCGCTATGATCCAACTC-3′,floR-R:5′-CCCAAAAAGCCGGACTCGCGAAG-3′。PCR反应体系(25 μL):2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL,2种引物各1 μL,模板2 μL,ddH2O补充至25 μL。PCR反应条件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,63.5 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共30个循环;72 ℃ 10 min。目标片段长度约510 bp。

1.2.10 药敏试验(K-B纸片法)

用PBS将菌液浓度调至含菌量约1.5×108CFU/mL[16],取200 μL涂布于含NAD的TSA-YE培养基上,无菌操作将药敏片贴在培养基上,37 ℃培养18～24 h,测量每个药敏纸片抑菌圈的直径大小。根据杭州微生物试剂有限公司《药敏实验纸片法的抑菌范围解释标准》中嗜血杆菌的药敏纸片抑菌标准判定结果。

1.2.11 动物致病性试验

20只小鼠随机分为2组(试验组、对照组),每组10只,试验组10只小鼠接种细菌的剂量为1.5×109CFU/只,对照组接种同体积的生理盐水。接种后观察并记录各组小鼠临床症状,发病和死亡时间及数量,剖检变化。

2 结果与分析

2.1 临床症状和病理学观察

临床观察见病猪精神沉郁、咳嗽、高热和腹式呼吸等症状。急性发病猪可见鼻孔流血、耳朵发绀,口鼻流涎带有血丝,快速死亡。剖检死亡猪只,肺脏两侧边缘出现紫红色,肺脏淤血、充血,呈现紫红色,肺表面覆盖一层黄色纤维素性渗出物,肺与胸壁、纵隔呈纤维素性粘连(如图1所示)。胸腔内大量积液,呈现典型的纤维素性出血性胸膜肺炎症状。腹股沟淋巴结、肺淋巴结和肠系膜淋巴结肿大(如图2所示)。

图1 纤维素性粘连

图2 肠系膜淋巴结肿大

2.2 细菌分离结果

在含10 μg/mL NAD的TSA-YE培养基、巧克力琼脂培养基、绵羊血琼脂培养基上均可见圆形隆起、光滑、半透明、直径为1～2 mm的浊白色小菌落(如图3所示)。在绵羊血琼脂培养基中产生β溶血。

图3 APP菌落形态

革兰染色镜检可见革兰阴性小球杆菌(如图4所示)。不含NAD的TSA-YE培养基上细菌生长不良,甚至无菌落生长。

图4 APP菌体形态(革兰染色,1 000×)

2.3 NAD依赖试验及“卫星”现象试验结果

分离株在含有NAD的TSA-YE培养基上均生长良好,而在不含有NAD的培养基上不生长。在TSA-YE培养基上呈典型“卫星”现象,越靠近金黄色葡萄球菌处,分离株菌落生长越大,反之越小,甚至不见菌落生长;与生物Ⅰ型APP的生长特征一致(如图5所示)。

图5 分离株“卫星”现象

2.4 CAMP试验结果

APP能产生CAMP因子,可促进金黄色葡萄球菌β-溶血素活性。在血琼脂平板上2种细菌交界处溶血能力增强,形成箭头状的溶血区(如图6所示)。

图6 分离株CAMP试验现象

2.5 生化试验结果

分离菌株生化试验结果:葡萄糖、蔗糖、乳糖、鼠李糖、蜜二糖、阿拉伯糖,甘露醇、肌醇、山梨醇和VP反应等均呈阴性;脲酶、硫化氢、吲哚、明胶生化反应呈阳性,符合猪胸膜肺炎放线杆菌的生化特性。

2.6 PCR鉴定结果

APPapxIV通用引物可PCR扩增出约346 bp的目的片段(图7),与预期目的条带大小一致。利用APP血清型分型引物,其中,APP血清型1型引物可PCR扩增出约754 bp的目的片段(图8),而其他APP血清型分型引物未扩增出目的条带,特别是APP血清型19型特异性引物也未扩增出目的条带。利用apxI、apxⅡ、apxIV的特异性引物,对APP分离株进行PCR扩增,分别获得了826 bp、1 069 bp、346 bp的目的片段,而apxⅢ基因特异性引物进行PCR反应未扩增出目的片段(图9)。floR基因检测引物可PCR扩增出约510 bp的目的条带(图10)。

M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准;1:阴性对照;2:apxIV PCR产物。

M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准;1:阴性对照;2:APP血清型19型PCR产物;3:APP血清型1型PCR产物。

M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准;1:阴性对照;2:apxI PCR产物;3:apxⅡ PCR产物;4:apxⅢ PCR产物;5:apxIV PCR产物。

M:DL-2 000 DNA相对分子质量标准;1:阴性对照;2: floR PCR产物。

2.7 核苷酸同源性分析

采用apxIV基因特异性引物进行PCR鉴定,测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析,与APP参考株(GenBank登录号:AF021919、AF188859、HM021153、AF188861)核苷酸同源性达99.7%以上。确定该分离株为APP,命名为APP-7T-1。

用APP血清型分型引物对APP-7T-1分离株进行PCR鉴定,仅APP血清型1型引物PCR扩增出目的条带。经测序、BLAST比对,分离株与APP血清型1型参考株(GenBank登录号:AF021919)核苷酸同源性达100%。同时,采用APP血清型19型特异性引物[3]进行PCR鉴别,没有扩增出目的条带,进一步证实APP-7T-1分离株为APP血清型1型,而不是APP血清型19型。

apxI、apxⅡ、apxIV、floR基因经PCR扩增、测序、BLAST比对,与APP参考株核苷酸同源性均达99.5%以上。

2.8 药敏试验结果

用APP-7T-1分离株对喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)、β-内酰胺类(头孢噻呋、头孢唑林、头孢拉定)、氨基糖苷类(卡那霉素、庆大霉素、丁胺卡那、氨苄西林、青霉素)、大环内酯类(红霉素、阿奇霉素)、四环素类(四环素、多西环素)、磺胺类(复方新诺明)、酰胺醇类(氟苯尼考)等进行药敏试验,结果显示,APP-7T-1分离株对喹诺酮类(环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星)具有敏感性,对其他药物不敏感或低敏感(表3)。

2.9 动物致病性试验结果

试验组小鼠均表现出反应迟钝,闭眼缩脖,呆立角落,被毛扎立,活动停止,3 d内全部死亡,剖检可见肺脏弥散性出血、脾脏肿大等症状。无菌采集发病死亡小鼠肺脏、脾脏,均可分离出猪胸膜肺炎放线杆菌,空白对照组小鼠全部正常(图11)。

A:试验组致病小鼠;B:对照组正常小鼠。

3 讨论

当前国内尚未有对APP血清型19型的公开报道,因此,本研究在鉴定APP血清型1、2、3、5、6、7、8、12型的基础上,还开展了对血清型19型的鉴定。通过鉴定,确认了本次新疆南疆发病猪场发生的是APP血清型1型。据流行病学调查,该猪场发病前2个月曾从北疆某猪场引进后备种猪,此次发病是否与引种有关系,仍需做进一步研究。本研究结果与公开报道的新疆南、北疆鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌血清型存在差异,因此以何种血清型为主要流行优势菌株仍需要做大量的流行病学调查。

APP的毒力因子有多种,如溶血外毒素(Apx)、菌毛、荚膜多糖、脂多糖、外膜蛋白、转铁结合蛋白、蛋白酶、黏附因子等。其中,溶血外毒素是APP导致猪发病的主要毒力因子。尽管脂多糖能引起肺部炎性细胞渗出,但不足以诱发胸膜肺炎的特征性病变。而溶血外毒素是本菌最重要的毒力因子,不同APP的血清型菌株可产生4种不同的细胞毒素,分别为ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ。这些毒素具有细胞毒性或溶血性,是一种穿孔毒素,属于含重复子毒素(repeats-in-toxin,RTX)家族[5]。不同的APP血清型含有的毒素不尽相同,APP血清型中1、5、9、11型可产生ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅣ。ApxⅠ毒素具有很强的溶血活性、细胞毒性,而ApxⅡ毒素、ApxⅣ毒素则相对较弱。本研究中分离株被鉴定为APP血清型1型,且检测到分离株中含有apxⅠ、apxⅡ、apxⅣ基因,致病性试验中该分离株可引起试验动物发病、死亡,证实该分离株具有致病性。

氟苯尼考(florfenicol,FFC)是用于APP治疗的常用抗生素药物之一,不同地域分离获得的APP分离株耐药性存在一定的差异。近年来临床上已检测到其相关耐药基因floR[17],给APP的治疗带来一定难度。本研究中药敏试验结果显示,分离株对氟苯尼考具有耐药性,同时,在分离株中检测出floR耐药基因,耐药基因的检出与药敏试验结果基本一致。

目前,免疫接种疫苗依然是APP防控的重要手段之一,由于地域差异、血清型不同,各型间交叉保护力存在差异,因此,选择合适疫苗显得尤为重要。对于已感染猪场或流行率较高的猪场,幸存猪多半为带菌猪,很难控制,因而猪场在引种时应十分谨慎,杜绝从疫区引种,最好从疫苗接种完全、从未发病的猪场引种。

4 结论

经病原学、分子生物学鉴定分析,证实该猪场发病死亡猪主要是由APP所致,且该分离株为生物I型(依赖NAD)、血清型1型猪胸膜肺炎放线杆菌。