青蒿素及其衍生物对细胞自噬调控的研究进展

邓海莲，吴月莹，沙文月，罗金花，杨宇，冯德辉

1 广东医科大学 第一临床医学院，广东 湛江 524000；2 广东医科大学附属医院老年医学科

青蒿素（ART）及其衍生物除具有抗疟疾作用外，还能抑制肿瘤细胞生长、分裂、迁移［1］。另外，它们还具有抗纤维化、抗病毒、消除炎症等作用［2-3］。ART 及其衍生物具有共同的基团：含有过氧化桥的倍半萜内酯，因此具有相似的药理特性，包括下调氧化应激［4］、免疫抑制［5］、诱导细胞凋亡［6］、调控细胞自噬［7］等。现就ART及其衍生物调控自噬治疗疾病的研究进展及相关信号通路综述如下。

1 青蒿素及其衍生物与自噬的关系

我国古代医者在古籍中曾提及“青蒿一握，以水二升渍，绞取汁，尽服之”治疗疟疾。“青蒿”是蒿科草本植物，具有凉血解毒、消除骨热、避暑、防止疟疾复发和消除黄疸的功效［8］。蒿科草本植物是我国民间俗称的“甜艾草”，亦是传统中药常用的一味药材，而ART 便是从蒿科草本植物中分离得到。因ART 溶解性差、生物利用度低，双氢青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等衍生物相继问世。目前ART 及其衍生物是应用最广泛、认可度最高的抗疟疾药物，它们具有共同的基团：含有过氧化桥的倍半萜内酯，决定了它们具有相似的作用机制。过氧化桥在ART 及其衍生物发挥抗疟疾作用过程中至关重要［9］。近年来，ART及其衍生物被发现除了具有抗疟疾作用外，还能抑制肿瘤细胞的增殖和分化［1］，并且与细胞周期阻滞、氧化应激［4］、细胞凋亡和自噬［7］等机制相关。

20世纪50年代，首次在酵母中发现了自噬体和自噬现象［10］，电镜下观察到胞质内自噬体的形成是一个连续性过程。自噬被激活后，首先在内质网出现隔离膜；随后延伸双层膜结构包裹受损的蛋白质或者细胞器，形成成熟自噬体，在一系列自噬蛋白协助下转运至溶酶体；接着双层膜结构与溶酶体膜相融合，包裹的蛋白质或者细胞器释放入溶酶体，被溶酶体酶降解，完成自噬过程。根据降解的底物不同，自噬可分为非选择性自噬和选择性自噬，非选择性自噬主要在饥饿环境下被激活，降解受损物质，形成代谢循环利用环，为细胞提供营养和能量；而非选择性自噬主要与保护细胞结构相关，根据作用的对象不同，可分为线粒体自噬、过氧化物酶自噬、内质网和核糖体自噬等。同时，自噬也被认为是一种Ⅱ型程序性细胞死亡，过度的自噬不仅不能保护细胞，反而会导致细胞死亡。自噬对机体的双刃剑作用让其在人类肿瘤及代谢性疾病、神经系统疾病中发挥重要作用。

相关文献报道，ART 及其衍生物除了抑制肿瘤细胞生长繁殖外［7］，还能通过调控自噬增加耐放化疗肿瘤细胞对药物的敏感性［11］。此外，ART 及其衍生物通过调控自噬降解肝硬化的细胞外基质沉积、改善肝细胞损伤、抑制甚至逆转肝纤维化进程［3］。相关研究表明，ART 及其衍生物还能调控自噬，抑制滑膜的异常细胞增殖，修复软骨细胞异常表达，具有改善骨关节炎的潜质［12］。血管细胞发生自噬是血管内各类细胞在缺氧、血流剪切力增强等应激环境下降解受损蛋白质、为细胞提供能量以及修复受损细胞的保护机制，ART 及其衍生物被发现能调控自噬、修复受损的血管细胞［13］。同时，研究表明ART及其衍生物对肾脏疾病尤其是足细胞相关性肾脏疾病，具有一定的治疗潜力［14］。总的来说，ART 及其衍生物已批准用于临床，其安全性、有效性已经在一定程度上得到保证，根据药物特性和疾病特点，开发旧药新功能一直是有吸引力的命题，因此ART 及其衍生物的临床应用会受到越来越多的关注。

2 青蒿素及其衍生物对自噬调控的相关信号通路

2.1 哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路mTOR 是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，ART及其衍生物被发现能通过调节mTOR 表达调控自噬，影响生长因子、氧化应激因子等分泌，从而调控能量代谢、调节蛋白质合成和分解。mTOR 是信号通路中间站，与自噬调节相关的上游通路包括磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号通路和腺苷单磷酸激活的蛋白激酶信号通路（AMPK）。上游信号通路激活后促进mTOR 磷酸化使其活化，活化的mTOR 诱导下游信号因子Unc-51 样自噬激活激酶（Ulk）磷酸化而失活，从而抑制自噬的发生［15］。

2.1.1 PI3K/Akt/mTOR 信号通路 PI3K/Akt/mTOR 信号通路是一条经典的自噬信号通路，与细胞的生长代谢、周期调节有密切关系。在营养充足情况下，PI3K/Akt/mTOR信号通路激活，mTOR活化促使Ulk 637 号位和757 号位的丝氨酸（Ser308 和Ser757）磷酸化而失活，进而抑制Ulk复合物的活性，抑制自噬启动。在饥饿或者细胞应激期间，mTOR活性受到抑制，Ulk 特定位点的磷酸化被解除，活化的Ulk 复合物随后转移到内质网的隔离膜上，启动自噬。研究表明，ART 及其衍生物能影响这条通路的上中下游其中一两个环节从而调控自噬。LIU等［13］在人脐静脉内皮细胞模型中发现，相比对照组，双氢青蒿素组微管相关蛋白1 轻链3（LC3-Ⅱ）表达水平更高，Akt、mTOR、核糖体S6蛋白激酶（p70S6K）磷酸化水平更低。通过siRNA 干扰沉默自噬相关蛋白ATG5 能减弱双氢青蒿素组LC3-Ⅱ水平的高值，而使用mTOR 抑制剂雷帕霉素预处理后，双氢青蒿素组未出现LC3-Ⅱ表达进一步升高，上述结果表明Akt/mTOR 通路活性下调是双氢青蒿素诱导血管内皮细胞发生自噬的机制。姜广利等［16］将宫颈癌HeLa 细胞作为研究对象，随机设置对照组、双氢青蒿素组、顺铂组及双氢青蒿素加顺铂组，实验结果发现，双氢青蒿素加顺铂组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达低，而p-mTOR/mTOR 和 p-Ulk /Ulk 表达升高，提示双氢青蒿素可能通过激活mTOR/Ulk 信号途径抑制自噬，从而提高宫颈癌的化疗敏感性。在顺铂耐药胃癌细胞SGC7901/DDP 体外模型中，ZHANG 等［11］研究发现，双氢青蒿素干预后，使用mRFP-GFP-LC3腺病毒转染和透射电子显微镜发现细胞内自噬增强，蛋白质印迹检测发现PI3K、Akt 和mTOR 磷酸化水平降低，表明双氢青蒿素通过PI3K/Akt/mTOR 信号通路诱导自噬，克服了癌细胞耐药特性引发细胞死亡，可作为治疗耐药性胃癌的潜在药物。

2.1.2 AMPK/mTOR 信号通路 AMPK 是一种能量感应蛋白，维持能量代谢平衡，当机体AMP/ATP值上调或者下调时，AMPK 启动相关信号通路干预能量流动，同时调节能量产生和能量消耗途径来储存机体内能量。在能量充足情况下，活化的mTOR除了直接磷酸化Ulk 使其失活外，还能通过破坏AMPK 与Ulk 之间相互作用来阻止Ulk 活化，抑制自噬启动。而能量缺乏时，AMPK 被激活，活化的AMPK 抑制mTOR 的磷酸化，其对Ulk 的抑制被解除，启动自噬。DU等［17］探究双氢青蒿素干预白血病细胞株的实验中观察到，双氢青蒿素能上调LC3-Ⅱ、ATG5、ATG7、Beclin1等自噬相关蛋白表达，同时p-AMPK/AMPK 表达水平升高，而mTOR 磷酸化被抑制，下游蛋白p70S6K 表达增加，表明双氢青蒿素通过调节AMPK/mTOR 信号通路激活自噬，诱导细胞死亡。在此基础上，敲除ATG7 基因或者使用自噬抑制剂（3-MA 或BafA1）后，自噬相关蛋白表达明显下降，自噬被抑制，双氢青蒿素对白血病细胞株的毒性变小，而使用雷帕霉素对mTOR 活性抑制后加剧了双氢青蒿素激发的细胞死亡。此外，研究还发现双氢青蒿素诱导的自噬能增加细胞内铁蛋白及过氧化物表达，诱导缺铁性贫血，导致白血病细胞株死亡，表明双氢青蒿素可能是治疗白血病的有效药物。

2.2 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路MAPK 是一组真核保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，可通过调节自噬参与细胞分化、增殖等生理活动，与自噬相关的亚基主要包括c-jun N 端激酶（JNK）、细胞外信号调节激酶（ERK1/2）及p38 三种亚基。MAPK 亚基调节自噬的机制错综复杂，有时甚至截然相反，尤其是在ATR 及其衍生物等药物特定的处理条件下如何精细调控细胞自噬仍未被阐明。研究表明，MAPK/JNK激活后可以促使Bcl-2家族蛋白磷酸化，从而将Beclin1 从复合体中游离出来，与自噬相关蛋白Vps34结合，促进自噬体成核，同时JNK 还可以直接激活相关自噬基因ATG 促进自噬。JIA等［18］在研究双氢青蒿素对胰腺癌细胞株作用时发现，相比对照组，双氢青蒿素组LC3-Ⅱ、JNK、Beclin1表达增强，mTOR 表达减弱，使用JNK 抑制剂或者siRNA 干扰沉默JNK 后，双氢青蒿素组Beclin1 水平下调，自噬表达减弱，细胞死亡率升高，表明双氢青蒿素通过MAPK/JNK 信号通路诱导了胰腺癌细胞株发生保护性自噬，抑制JNK 表达有可能增强双氢青蒿素的治疗功效，JNK 基因沉默有可能成为治疗胰腺癌的手段。然而，YAO 等［19］发现MAPK/JNK 信号通路在调节双氢青蒿素衍生物L-A03诱导人乳腺癌症细胞发生自噬时起着相反的结果。实验结果显示，处理乳腺癌细胞株MCF-7 时，L-A03 组自噬相关蛋白LC3-II表达增强，但JNK磷酸化水平降低，而使用JNK 特异性抑制剂SP600125 后，L-A03 组自噬表达进一步增强，乳腺癌细胞株死亡率更高，类似的结果在另外一种乳腺癌细胞株MDA-MB-231中得到印证，表明双氢青蒿素衍生物L-A03 诱导乳腺癌细胞发生自噬可能与MAPK/JNK 信号通路受抑制相关，JNK 基因失活有可能成为治疗乳腺癌的靶点。MAPK/JNK 信号通路在自噬调节中极其复杂，有时甚至互相矛盾，这一现象在其他研究中亦有体现［20］，考虑与药物激活其他的细胞活动如凋亡、炎症、氧化应激等间接影响了自噬调节的方向有关，仍需设计更多实验进一步明确其中机制。LIU 等［21］采用双氢青蒿素另外一种衍生物DHA-37 处理非小细胞肺癌体外模型时发现，DHA-37 组自噬表达增强，同时ERK1/2、p38 以及高迁移率族蛋白B1（HMGB1）表达明显升高，而JNK1表达和对照组差异无统计学意义，使用ERK1/2 抑制剂PD98059 逆转了LC3-Ⅱ/LC3-I 上调，并阻止了DHA-37 诱导的HMGB1 增加，阻止了DHA-37诱导的细胞死亡，而使用p38抑制剂SB203580 也出现了相似的实验结果，表明DHA-37诱导的自噬增强导致肺癌细胞株死亡可能与MAPK/ERK和p38信号通路相关。该实验还设计了肺癌异种移植裸鼠体内模型，发现p-ERK、p-p38、HMGB1、LC3-Ⅱ水平升高，进一步印证了上述结论。上述研究表明，MAPK 信号通路在ART 及其衍生物调控自噬治疗相关疾病的发展过程中起着举足轻重的作用。

2.3 活性氧（ROS）信号通路 ROS 是一组化学性质活泼、氧化性强的物质，包括羟自由基、双氧水、超氧阴离子、一氧化氮等。体内的ROS 水平往往维持在极低状态，当机体受到刺激时会产生大量的ROS，引发细胞氧化应激，进而诱导细胞炎症、凋亡、自噬等。相关研究发现，在ART及其衍生物实验中，ROS能通过多种细胞信号通路调控自噬，促进细胞发生自噬性死亡或自噬性保护，同时自噬亦能逆反馈调节ROS 水平。DU 等［22］在食管癌细胞系中发现双氢青蒿素诱导细胞自噬。MA 等［23］在此基础上进一步研究了其中机制，发现细胞内的ROS 水平明显上调，而使用抗氧化剂NAC 阻断ROS 后，观察到双氢青蒿素组自噬水平较前明显下降，细胞活性抑制明显减弱。HU 等［24］通过对骨髓瘤、白血病、直肠癌、宫颈癌等多种细胞株的研究发现，双氢青蒿素通过抑制各细胞株铁蛋白重链（FHC）和锰超氧化物歧化酶（MnSOD）表达，引起ROS 累积，诱导细胞自噬，实验发现，抗氧化剂阻断ROS 可抑制双氢青蒿素诱导细胞自噬。上述研究表明，双氢青蒿素诱导细胞自噬可能与ROS水平相关。SHEN等［25］研究发现，双氢青蒿素抑制骨肉瘤细胞增殖，对骨肉瘤有潜在治疗价值，其作用机制主要与铁依赖的ROS水平上调、激活上游自噬过程、阻断后期自噬降解相关。

2.4 核因子-κB（NF-κB）信号通路 NF-κB 是一组调控细胞分化、增殖的转录因子家族，主要有Rel-A（p65）、Rel-B、c-Rel（Rel）、NF-κB1（p50）、NF-κB2（p52）等5 种亚型。一般情况下，NF-κB 的转录并不活跃，其与IκB 家族抑制蛋白结合形成无活性复合体，当受到外界刺激时，IκB发生磷酸化，NF-κB被激活，向细胞核转移，NF-κB活化，进而调节下游因子。NF-κB 参与了细胞凋亡、坏死、炎症、自噬等过程。研究发现自噬与NF-κB 信号通路有相互交叉作用，NF-κB信号通路受抑制，自噬激活，机体产生保护或者损伤作用，反之亦然。HU 等［24］研究发现，双氢青蒿素通过抑制NF-κB核转位来调控各种癌细胞株发生自噬。许浩等［26］在宫颈癌细胞株体外模型中观察发现，相比对照组，双氢青蒿素组自噬表达增强、NF-κB表达被抑制，并且细胞增殖抑制明显，双氢青蒿素诱导自噬抑制宫颈癌细胞株活性的机制有可能与阻断NF-κB 信号通路相关，但该实验并未设计NF-κB 通路激活剂或抑制剂进一步印证。JIANG等［12］将软骨细胞作为研究对象，随机设置对照组、肿瘤坏死因子（TNF-α）组、双氢青蒿素组和TNF-α+双氢青蒿素组，结果发现TNF-α+双氢青蒿素组自噬水平较双氢青蒿素组明显升高，此外TNF-α 组p65 表达增强并且出现核转位、IκB 表达降低，但用双氢青蒿素预处理后降低了p65 表达，并且诱导了软骨细胞中IκB 的积累，说明双氢青蒿素抑制了TNF-α 刺激的NF-κB信号传导。该实验还使用了NF-κB抑制剂SM7368，观察到IκB的表达增强，NF-κB途径受到抑制，但软骨细胞中LC3-Ⅱ水平升高，验证了NF-κB通路在双氢青蒿素诱导软骨细胞发生自噬的作用。LI 等［27］研究卵巢癌细胞系发现，青蒿琥酯和双氢青蒿素诱导的自噬可能抑制了卵巢癌细胞系的NF-κB信号通路。相关研究表明，NF-κB 信号通路影响mTOR 蛋白的磷酸化从而调节细胞自噬［28］，但并未有研究直接表明ART 及其衍生物处理时，NF-κB 信号通路能调节mTOR蛋白的磷酸化。

综上所述，青蒿素及其衍生物可通过mTOR、MAPK、ROS、NF-κB等信号通路调控自噬，对多种疾病起到缓解作用。