中医证候小型猪模型的研究进展❋

张丽萍,李 丹,刘 春,吴晓筱,段俊国

(1.成都中医药大学,成都 610075;2.成都中医大银海眼科医院,成都 610084;3.中医药眼病防治与视功能保护四川省重点实验室,成都 610075)

小型猪在解剖、生理、生化等方面与人类极为相似,因此被视为理想的动物模型,广泛应用于医学领域。在中医药现代化的进程中,小型猪模型逐渐应用于不同中医学科,如中医理论[1]、中医诊断[2]、中药方剂[3]、针灸推拿[4]等,并不断取得新的研究成果。中医证候是疾病发生和演变过程中某阶段以及个体当时所处特定内外环境本质的反映,疾病的病因和病理共同构成了证候的本质,证候主要体现疾病某一阶段的病理状态。中医重视“辨证论治”,证候动物模型的研制对疾病的病因、发病机制的探索及中医药的作用机制、物质基础和新药研发等方面均具有重要的意义。本文将对不同中医证候小型猪模型的研究进展进行综述,以期能为相关研究提供思路。

1 血瘀类证候模型

中医证候小型猪模型最早始于冠心病病证结合模型,研究者通过手术干预的方式建立冠心病血瘀证小型猪模型。

王伟团队采用在小型猪左冠脉前降支放置Ameroid缩窄环的方法,建立冠心病心肌缺血血瘀证小型猪模型[5]。该研究通过在小型猪左冠脉前降支第一间隔支起始部远端放置Ameroid缩窄环,使之缓慢膨胀压迫冠脉,影响血行,最终造成慢性心肌缺血血瘀证候。并于术后动态观察模型动物行为改变及一般行为、舌象、血液流变学等指标,发现术后4～8周为血瘀证时间窗[6]。以活血化瘀之丹七片对该模型进行干预,结果显示其对心肌缺血及血瘀证的部分表现具有改善作用,可视为模型制备成功的反证[7]。同时对该证型进行了相关蛋白组学[7]和代谢组学[8-10]等方面的研究。之后该团队在前期基础上再次展开实验,延长指标观测时间,于术后8～12周对模型动物进行证候评价,并在血瘀证指标基础上加入小型猪摇尾次数以评价其精神状态和活动度,作为气虚的评价指标,辨证这段时期为气虚血瘀证时间窗[11],基于一般状态、舌色、活动度、血液流变学、心电图、冠脉造影、超声心动图等指标对该模型进行证候评价,制定小型猪观察量表,并结合不同时期的研究结果,发现该模型由血瘀到气虚血瘀的证候演变规律与“血为气之母”“因瘀致虚”等中医理论相呼应,一定程度上促进了中医理论的现代化,并为之后的相关研究提供了模型基础。其后,该团队再次建立冠心病心功能不全血瘀证小型猪模型,并基于该模型从转录组学和代谢组学对益气通脉、活血止痛之芪参颗粒治疗冠心病心功能不全气虚血瘀证可能存在的有效药物靶点和效应机制通路、药理机制进行了探讨[12]。杨爱国[13]则采用开胸结扎冠脉前降支的方法制备“胸痹”“心痛”心脉瘀阻证小型猪模型。该造模方法通过手术损伤心脉,使血行受阻而致血瘀;且直接结扎血管致血运受阻,致瘀阻心脉,最终形成胸痹心脉瘀阻证。术后正常饲养15 d,通过体征、血液流变学、心电图、心肌细胞超微结构、核转录因子 (nuclear transcription factor,NF)-κB和细胞间黏附分子(intercellular adhension molecule,ICAM)-1等指标判定造模成功。在模型建立后对冠心病的治疗要穴内关穴予以针刺干预作为反证,并基于各观测指标对内关穴治疗胸痹的机理进行了探讨。

除了病证结合血瘀证模型,单纯的血瘀证候模型在病因造模和病理造模方面也都取得了一定的研究成果。病因造模方面,冯麟等[14]采用失血联合冰冷刺激的方法进行造模,失血以致血虚血瘀、冰冷刺激以致寒凝血瘀,从而建立血虚寒凝血瘀证小型猪模型。造模前后基于体征、血常规、血液流变学、凝血、肠系膜微循环、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、血栓素(thromboxane,TX)B2、6-酮-前列环素(6-keto prostaglandin,6-Keto-PG)F1α等指标进行观察和辨证。模型建立后,以温经散寒、养血通脉之当归四逆汤进行干预,结果显示模型动物的症状、体征和病理变化均有改善,反证模型制备成功。病理造模方面,赵丽峰[15]采用静脉注射10%高分子右旋糖酐溶液的方法,成功复制血瘀证小型猪模型。高分子右旋糖酐进入血液,被红细胞吸附,在红细胞之间起桥梁作用,产生红细胞聚集[16],从而导致组织血流灌注明显减少,引起严重的组织缺氧,很快出现微循环障碍,可一定程度模拟血瘀状态,研究者通过造模前后血液流变学、凝血、血常规、血糖、血脂、D-2聚体等指标对模型进行评价。

2 痰证类证候模型

杨关林团队对脾虚痰浊证候进行了长期且深入的研究,并选择小型猪作为实验动物建立病理模型,基于该模型对脾虚痰浊证候展开了较为充分的探索,不仅完成了模型的制备,还逐步完善了模型评价、病证结合等方面的研究。通过高热量喂饲结合跑步过劳的方法,成功建立脾虚痰浊证候小型猪模型[17]。以高热量喂饲模拟中医饮食不节病因,以跑步过劳模拟中医劳倦过度病因。通过观测体温、体尺值、粪便黏度、等待喂食行为、皮毛、口色、抗疲劳能力等指标对模型进行评价。并随后建立了小型猪脾虚痰浊证候评价量表,但因脉象采集困难而未将其纳入[18]。其后,该团队进一步采用不同的造模方法,尝试建立不同的病证结合模型,如采用高热高脂喂饲、跑步过劳、球囊拉伤冠脉联合的方法,成功建立了冠脉粥样硬化脾虚痰浊证模型[19],采用跑步运动联合高脂单笼喂饲的方法,成功建立了高脂血症脾虚痰浊证模型[20],采用隔日游泳、高脂饲料、冠脉结扎法联合的方法,成功建立了冠心病脾虚生痰证模型[21]。在模型建立相对完备后,基于各模型分别从不同角度进行了现代化的探索。基于脾虚痰浊证候小型猪模型对神经内分泌免疫网络相关指标进行了观察,并对病理机制进行了探讨[22]。基于冠脉粥样硬化脾虚痰浊证小型猪模型,从线粒体能量代谢[23]、胆固醇代谢[24]、水通道蛋白(aquaporins,AQPs)[25-26]、脑组织β淀粉样蛋白(amyloid beta,Aβ)[27-28]等对健脾祛痰化瘀法的作用和机制进行了研究与探讨;从线粒体能量代谢方面[29]、肝脏脂质代谢和AQP3、AQP4、磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein,CREB)等方面对健脾化瘀祛痰方的作用和机制进行研究和探讨[30];从小肠蛋白组学、小肠和肝脏线粒体能量代谢角度对健脾祛痰化瘀方药进行疗效评价和机制探讨[31-32];从线粒体能量代谢角度对益气健脾化痰祛瘀方进行药效评价和机制探讨[33-34]。基于冠心病脾虚痰浊小型猪模型,对“从脾论治”法进行疗效评价[35]。基于高脂血症脾虚痰浊小型猪模型,对健脾祛痰法的作用机制进行了研究[36]。

该团队在不断完善小型猪模型制备的过程中,创新开发了许多小型猪专用的专利产品,如小型猪跑步机[37]、小型猪臀宽测量卡尺[38]、粪便黏度测定装置[39]、小型猪转移笼[40],为小型猪实验提供了新的指标与方法。

3 痰瘀互结证候模型

痰瘀互结证小型猪模型当前仅见于冠心病病证结合模型。刘建勋团队采用高脂饲料喂饲结合冠脉球囊拉伤的方法进行造模,造模过程中,对模型动物的体质量指数(body mass index,BMI)、血脂、高敏C-反应蛋白(high-sensitivity C-reactive protein,hs-CRP)、体表心电图、冠脉造影、病理学指标等进行监测和辨证,成功建立了冠心病痰瘀互结证小型猪模型[41]。该团队在完成模型建立后,进一步制定小型猪痰瘀互结证冠心病中医证候诊断及评分标准[42],随后基于前期研究结果再次展开实验,进一步规范化采集舌象,从色度学进行分析,并探讨了脉搏图在该动物模型中的应用,研究者认为脉搏图可以一定程度反映疾病的发展规律,但复合因素造模的动物疾病模型其应用可能受限,而无创血流动力学指标进行的脉象标准量化评分则可准确稳定地反映疾病特点[43]。并从内皮组织损伤、冠脉血管斑块稳定性到蛋白组学、细胞死亡模式等层面研究冠心病疾病模型的病理机制,揭示痰瘀互结证候的演化过程[44]。在之后的实验中,结合血脂代谢、炎症反应、血液流变学等相关指标变化规律,探索冠心病痰瘀互结证“痰、毒、瘀”病机演变的客观规律,推动冠心病中医病因病机学发展[45]。基于该模型从中医证候评分[46]、心功能[47]、血脂和血液流变学[48]等角度对活血化瘀、祛痰行气之痰瘀同治方进行药效评价。基于该模型进行了方证相应研究,选取行气通阳、祛痰散结之瓜蒌薤白半夏汤作为化痰方,活血祛瘀、行气止痛之血府逐瘀汤作为祛瘀方,瓜蒌薤白半夏汤合血府逐瘀汤作为痰瘀同治方,结果显示痰瘀同治可以更好地体现方证相应的治疗原则而取得最佳疗效[44];对比了益气复脉、养阴生津之生脉胶囊和宽胸通阳、化痰散结、活血化瘀之丹蒌片的疗效,结果显示,比之方证不相应的生脉胶囊,与痰瘀互结证方证相应的丹蒌片疗效更佳[49]。

潘永明等[50]通过高脂饲料喂养、静脉注射维生素D3(vitamin D3,VD3)和异丙肾上腺素(isoproterenol,Iso)的方法,成功建立慢性心肌缺血痰瘀互结证小型猪模型。通过高脂饲料喂养联合VD3损伤内皮细胞,破坏血管内皮的完整性;通过注射Iso增加心率和心肌收缩力,使心肌耗氧量增加,导致心脏超负荷和心肌微循环障碍、冠脉痉挛和心肌梗死或心肌细胞肥大、坏死,从而共同参与推进慢性心肌缺血的病程。监测指标为体质量、心电图、血脂、心肌酶、血液流变学、炎症、心脏指数和心肌缺血面积等,其中,研究者认为脂质代谢、血液流变学、心肌酶代谢和炎症等指标可作为痰瘀互结证的客观生化物质基础,这些变化可反映中医“痰瘀互结、瘀毒致变”的病理发展进程。

张慧等[51]通过高脂饲料喂饲的方法建立高脂血症痰湿证小型猪模型,模型判定指标为体质量、体尺、腹围、血脂和主要中医证候体征变化,并以利水渗湿、温阳化气之经方五苓散进行干预,结果显示痰湿程度有所减轻,可视为模型成功的反证。

4 气阴两虚证候模型

气阴两虚小型猪模型当前主要为刘建勋团队所建立,该团队为探讨有益气养阴、通脉止痛作用之通脉养心丸的疗效,选取小型猪为模型动物,采用介入技术球囊封堵冠脉左前降支30 min后撤出行再灌注损伤的方法,建立冠心病气阴两虚证模型[3]。研究者认为心肌缺血再灌注损伤后心功能不全所引起的体循环灌注不足的病理状态可对应气阴两虚证;而心肌缺血再灌注损伤后心肌细胞丧失导致心功能下降,一定程度是心气虚的体现;在机体体循环长期有效灌注不足的状态下,引起血管内和组织间隙液体循环失调,二者作为关键病理环节共同参与了气虚不化津、气阴两虚的病理过程。该研究于术前和术后4周分别检测了无创血流动力学、舌象、脉象等指标。术后4周对模型动物施以生脉胶囊和通脉养心丸,二者皆为冠心病气阴两虚证的对证方剂,结果显示二者均可不同程度改善冠心病气阴两虚证小型猪舌象和脉象,保护心肌组织,恢复心脏血流动力学的异常状态,可视为模型制备成功的反证。

5 阳虚类证候模型

王郭琦等[52]采用含有1%腺嘌呤和1%地塞米松饲料喂饲的方法,成功制备肾阳虚小型猪模型。腺嘌呤终代谢产物尿酸可刺激肾组织,引起炎症反应,造成连续病变,最终导致肾功能损害[53];地塞米松等激素主要通过给予外源性糖皮质激素,导致垂体前叶的促肾上腺皮质激素释放受到抑制,导致肾上腺皮质分泌类固醇激素减少,从而表现为肾阳虚的症状[54]。证候判定指标为宏观表征,体温,血清睾酮、游离三碘甲状腺原氨酸(free triiodothyronine 3,FT3)、游离甲状腺素(free thyroxine 4,FT4)、促甲状腺素(thyroid stimulating hormone,TSH)、总三碘甲状腺原氨酸(total triiodothyronine,TT3)、总甲状腺素(totalthyroxine,TT4)、尿素氮(blood ureanitrogen,BUN)、肌酐(creatinine,Cr)等。相波[55]则选择肌肉注射氢化可的松琥珀酸钠的方法复制虚寒证候小型猪模型,观测指标主要为小型猪证候观测表、生命体征、免疫学指标、甲状腺指标、物质能量代谢指标等。

6 实热证候模型

肖建强[56]通过腹腔注射脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)悬液的方法,成功复制实热证小型猪模型。模型评价指标主要有一般体征、TT3、TT4、补体3(complement3,C3)、C4、免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G、IgM、血糖、血细胞压积(hematocrit,HCT)、白细胞计数(white blood cell,WBC)、红细胞计数(red blood cell,RBC)、血小板计数(platelet count,PLT)、血沉(erythrocyte sedimentation rate,ESR)等。LPS属于中医学“毒”的重要组成部分之一[57],LPS侵入机体的过程,可视为热毒侵犯机体的过程,结合相关指标发现攻毒后不同时相的病理改变与温病病机病程的进展极为相似[58],LPS进入机体后,引发系统性免疫应答释放多种炎症细胞因子,炎症细胞因子过量会引起机体发热、血管通透性增加、中性粒细胞增多等炎症病理反应,因而,LPS常用于实热证、热毒血瘀证及温病卫气营血证模型的制备。

7 结语

对现有的中医证候小型猪模型相关研究进行整理后发现,中医证候繁复多变,当前虽已完成了部分证候模型的制备,但还有许多亟待完善,尚不足以满足临床和科研的需求。小型猪的病证结合模型当前多见冠心病病证结合模型,其原因在于小型猪的心脏解剖结构及侧支循环与人类相似,且猪的凝血因子和纤溶活性与人的相近程度高于其他动物。除此之外,小型猪作为理想的动物模型与人类相似之处还有很多,如免疫系统、肾脏、皮肤、眼球、鼻软骨等,尚待科研工作者的深入挖掘。

中医药现代化进程在某种程度上也是一个不断量化的过程。就中医证候小型猪模型的制备而论,当前工作主要集中在四诊信息的标准化采集和量化、证候量表的制定等方面。小型猪中医证候造模当首重四诊信息的采集。总结相关文献如下:一般情况包括精神状态及活动度、色泽(鼻唇、被毛)、饮食二便、体温(常为肛温、耳温、鼻温);舌象的采集和分析方面,通常使用相机结合比色卡以固定距离和固定光源垂直拍摄舌面,再基于专业软件,如Adobe photoshop等进行分析;脉象存在不同采集方式,可基于血流动力学参数进行脉象判定,亦可基于脉象仪进行脉象信息采集和分析。可见,四诊信息采集处在未统一标准的阶段,现阶段研究者获取的小型猪的四诊信息主要基于望诊(包含舌诊)和脉诊得来,未来小型猪四诊信息逐渐规范化、量化将会更有助于相关科研工作的推进。

在实验过程中,可依据具体实验情况适当延长实验周期,把握合适或规律的时间节点采集和观察相应指标,从而对病理过程进行更加全局和动态的观察,以获得对模型更加宏观的把控,对证候的发生发展与转变才会有更加确切的体察。

完成造模后,在模型成功的基础上,当进一步完善证候量表的制定,这有利于该模型的推广应用,便于同行交流、应用和不断完善,最终形成学界公认的证候判定标准,进而推动中医药现代化进程。