miR-139-5p在老年胃癌中的表达及其与患者临床病理特征和预后关系

沙 聪 张一心 袁爱军 吴仁极

南通瑞慈医院普外科,江苏省南通市 226009

microRNAs(miRNAs)是一类长度约22个核苷酸的小RNA分子,且不能为蛋白编码。miRNA在基因转录后的调控作用已被众多研究所证实[1-2]。通过mRNA碱基对特定基因3’-未翻译区(3’-UTR)中的特定靶位点的识别,miRNAs在生理或病理条件下能有效地降低靶基因的mRNA水平,从而抑制该基因的翻译。由于mRNA靶基因非常广泛,通过影响这些靶基因的表达进而影响细胞增殖、凋亡、分化、血管生成等关键生物学过程[3]。因而,miRNA在肿瘤发生、发展中起着重要的调节作用,根据不同的癌症类型或肿瘤细胞,同一个miRNA可能具有相反的生物学功能,或作为癌基因或作为肿瘤抑制因子发挥生物学功能。

miR-139-5p是从miR-139前体加工而来的成熟miRNA形式。虽然miR-139-5p在人宫颈癌中的肿瘤抑制作用已被证实[4],而其在胃癌中的研究较少,其生物学功能及分子机制并不十分清楚。在本研究中,笔者采用Real-time PCR、免疫组化等多种生物实验方法及生物信息分析技术,探讨miR-139-5p在胃癌中的生物学功能及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 胃癌患者及组织标本留取 选取我院2018年8月—2022年7月收治的38例老年(年龄>65岁)胃癌患者为研究对象,术中留取患者肿瘤组织、癌旁正常胃组织和区域淋巴结。患者组织手术切除后,立即置于液氮中速冻,然后转移至-80℃冰箱中保存。术后根据患者病理报告将淋巴结区分为转移淋巴结和未转移淋巴结。38例患者中男27例,女11例,中位年龄72岁(65～78岁)。

1.2 miR-139-5p靶基因预测 采用生物信息学分析方法,通过microRNA与mRNA相互作用预测软件Targetscan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)检索miR-139-5p的靶基因。

1.3 Real-time PCR检测miR-139-5p和TCF4表达 根据试剂盒说明,使用TRIzol试剂(Life Technology,Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA)从细胞中提取总RNA。采用逆转录酶M-MLV(RNase H-)(TaKaRa,Tokyo,Japan)将总RNA反向转录成microRNA-cDNAs,使用特定的引物(中国广州,Ribonobio)及M-MLV逆转录酶(美国Promega公司)合成了该基因的cDNA。随后使用SYBREx-Taq(Takara Bio,Inc.,日本)qRT-PCR反应。miR-139-5p、TCF4相对表达水平采用2-ΔΔCt法进行定量分析。以U6或GAPDH作为内参基因进行表达水平标准化。

1.4 免疫组化检测TCF4蛋白表达 采用免疫组化二步法对TCF4进行测定:首先对标本进行切片脱蜡等处理,然后进行抗原修复,消除过氧化物酶活性加入一抗,37℃孵育1h;然后用PBS冲洗。将试剂(Polymer helper)滴入其中,于37℃条件下孵育20min;滴入二抗,于37℃条件下孵育0.5h; PBS冲洗厚DAB显色5min。显色后在光学显微镜下进行观察,判断TCF4的表达情况。根据文献报道,TCF4阳性者光镜下胃癌细胞核及细胞浆呈现棕黄色。

2 结果

2.1 miR-139-5p在胃癌中的表达 正常胃组织和胃癌组织中miR-139-5p相对表达量分别为-3.06±1.43和-4.09±2.13,差异有统计学意义(t=2.46,P=0.016)。未转移淋巴结和转移淋巴结中miR-139-5p相对表达量分别为0.25±1.64和-1.59±1.67,差异有统计学意义(t=3.51,P=0.001)。癌旁正常胃组织和未转移淋巴结中miR-139-5p相对表达量显著高于胃癌组织和转移淋巴结,见图1。

图1 胃癌患者癌组织、癌旁组织、未转移淋巴结以及转移淋巴结中miR-139-5p相对表达量散点图

2.2 miR-139-5p靶基因预测 采用生物信息学分析方法,通过microRNA与mRNA相互作用预测软件Targetscan 7.2(http://www.targetscan.org/vert_72/)检索miR-139-5p的靶基因,结果显示TCF4基因3’-UTR区域ACUGUAC序列与miR-139-5p 5’-UTR区域UGACAUC结合紧密。提示TCF4可能为miR-139-5p的靶基因,见图2a。Real-time PCR结果显示,TCF4基因在胃癌组织和转移淋巴结组织中的表达水平显著高于对应癌旁组织(t=2.14,P=0.036)和未转移淋巴结组织(t=2.68,P=0.027),见图2b、2c。且癌组织中TCF4的表达水平与miR-139-5p表达水平呈负相关(rpearson=-0.42,P=0.03)。

2.3 TCF4蛋白表达水平 TCF4蛋白主要表达于细胞核和细胞浆,阳性表达呈现棕黄色颗粒均匀分布。38例患者癌组织中TCF4蛋白阳性26例(68.4%),阴性12例(31.6%)。

2.4 miR-139-5p、TCF4基因表达与患者临床病理特征关系 miR-139-5p表达水平与胃癌患者淋巴结转移(P<0.05)和肿瘤病理分级(P<0.05)有关,低表达组患者淋巴结转移比例和低分化比例较高。TCF4表达水平与胃癌患者淋巴结转移(P<0.05)和肿瘤浸润深度(P<0.05)有关,TCF4阳性表达患者淋巴结转移和肿瘤浸润浆膜层比例较高,见表1。

表1 miR-139-5p、TCF4基因表达与患者临床病理特征关系

2.5 TCF4基因表达与患者预后关系 在TCGA数据库中,根据TCF4基因mRNA相对表达水平分为高表达(≥TCF4表达中位数)和低表达患者。Log-rank检验显示,TCF4高表达组患者总生存(OS)显著低于TCF4低表达患者(HR=1.4,P=0.032),而高低表达患者无疾病进展生存(DFS)差异无统计学意义(HR=1.4,P=0.094),见图3。

图3 TCF4基因表达与患者预后关系

3 讨论

新近的肿瘤流行病学数据显示,2018年全球胃癌新发病例超过100万例,成为第五大常见癌症[5]。据估计,2018年全世界死于胃癌的人数约为78.3万,是第三大致死恶性肿瘤[6]。饮食因素,如亚硝酸盐和盐渍食品、幽门螺杆菌感染是已知的胃癌的主要危险因素。随着食品保存技术的改进和幽门螺杆菌的治疗,胃癌的发病率已呈现下降趋势[7]。然而,近年来近端胃癌的发生率上升,且预后较差。我国、日本等东亚国家胃癌发病率较高,占全世界胃癌患者的50%左右[8-9]。整体上,我国胃癌患者的预后较差,晚期胃癌比例较高,早期诊断水平低于欧美及日本等发达国家[10]。尽管胃癌的发病率和死亡率较高,但其发生的确切分子机制并未完全阐明[11-12]。癌基因和抑癌基因的时空异常表达,是胃癌发生的分子基础。近年来,随着高通量测序技术、芯片技术的不断发展,大量新的基因被发现并证实其相关生物学功能。miRNAs已被广泛证实在人体多种恶性肿瘤中存在差异表达,并扮演抑癌或促癌基因的角色[13-14]。

miR-139-3p和miR-139-5p是同一miR-139前体的成熟miRNA产物。miR-139-3p已被广发研究,证实其在多种人体肿瘤中呈现上调表达[15-16]。抑制miR-139-3p表达后,肿瘤细胞表现出增殖水平降低,而凋亡比例增高,提示miR-139-3p为一经典的癌基因,具有促癌作用[17]。而miR-139-5p相关研究报道较少,Ji等[4]在宫颈癌中的研究发现,miR-139-5p具有抑制肿瘤细胞增殖作用,认为其分子机制可能与其靶向调控TCF4表达,从而抑制Wnt/β-catenin 信号通路有关。

在本研究中,笔者采用Real-time PCR法检测了38例胃癌患者癌组织、癌旁正常胃组织、转移淋巴结和未转移淋巴结中miR-139-5p的表达情况。miR-139-5p在正常组织表达水平显著高于癌组织,同时在未转移淋巴结表达水平显著高于转移淋巴结。提示miR-139-5p可能在胃癌的发生及肿瘤的侵袭转移中发挥重要抑制作用。笔者同时采用miRNA靶基因在线预测软件对该基因的靶基因进行了预测,提示转录因子4(TCF4)基因3’-UTR区域ACUGUAC序列与miR-139-5p 5’-UTR区域UGACAUC结合紧密。TCF4可能为miR-139-5p的靶基因。为进一步证实TCF4为miR-139-5p靶基因的关系,笔者同时检查了胃癌患者TCF4的表达水平,结果提示TCF4在癌组织和转移淋巴结中的表达水平高于癌旁组织,且癌组织中TCF4与miR-139-5p表达水平呈现负相关。证实了生物信息分析结果,TCF4为miR-139-5p的靶基因。同时进一步分析TCF4和miR-139-5p高低表达与胃癌患者临床病理特征关系发现,miR-139-5p低表达组患者淋巴结转移比例和低分化比例较高。而TCF4高表达患者淋巴结转移和肿瘤浸润浆膜层比例较高,二者临床特征也呈负相关。为了进一步分析TCF4表达水平与胃癌患者预后的关系,笔者对TCGA数据库中的胃癌患者进行了总生存和无疾病进展生存分析,结果认为TCF4高表达组患者总生存(OS)显著低于TCF4低表达患者,而高低表达组患者无疾病进展生存(DFS)差异无统计学意义。

TCF4基因编码蛋白为转录因子4,该蛋白为一种碱性螺旋—环—螺旋转录因子。编码的蛋白质识别Ephrussi盒(“-box”)结合位点(“CANNTG”),这是免疫球蛋白增强子中首次发现的基序。该基因广泛表达,已证实在神经系统发育中发挥重要作用。该基因的缺陷是导致皮特—霍普金斯综合征的原因之一。此外,通常编号为10～37个重复单元的内含子CTG重复可以扩展到>50个重复单元,并导致Fuchs内皮性角膜营养不良。近年来陆续有文献报道,该基因的异常表达与肿瘤发生有关。Bi 等[18]研究显示miR-137通过靶向TCF4抑制结肠癌癌症细胞系的增殖、迁移和侵袭,证实TCF4表达水平降低后能够抑制肠癌细胞的增殖和转移生物活性。He等[19]通过miR-133a-5p下调TCF4表达,从而抑制肠癌细胞的增殖和转移,也证实TCF4在肠癌中发挥重要作用。TCF4下调表达后,导致肿瘤细胞增殖和转移能力减低的分子机制并不十分明确。相关研究认为,可能与一下机制有关:(1)TCF-4表达下调后,beta-catenin信号通路被抑制,而beta-catenin信号通路是细胞增殖的重要通路,因此肿瘤细胞增殖能力减低[20]。(2)TCF4表达减低后,Wnt/β-catenin/TCF4信号通路被抑制,导致细胞迁移增殖能力减低[21]。

综上所述,miR-139-5p在老年胃癌患者中低表达,并可能通过靶向调控TCF4抑制肿瘤的进展。TCF4高表达与胃癌患者总生存期减低有关,并有望成为胃癌预后不良的分子标志物。体内转染或上调miR-139-5p表达,为开发胃癌靶向药物提供了新的思路。但miR-139-5p靶向调控TCF4后导致老年胃癌患者肿瘤细胞增殖迁移能力减低的确切分子机制仍不十分明显,应进一步采用基因测序、免疫共沉淀等新技术,探讨明确其调控信号通路的分子机制。