姜荷花桑巴杂种后代鉴定及遗传多样性

柯玲俊，彭坤桦，陆銮眉，余惠文*

（1.闽南师范大学生物科学与技术学院，福建 漳州 363000；2.闽台特色园林植物福建省高校重点实验室，福建 漳州 363000）

姜荷花（Curcumaalismatifolia）为姜科姜黄属球根花卉，在夏秋季节开花，其不育苞片形态类似荷花，花形一般较大，具有颜色艳丽、瓶插期长的特点.因姜荷花具有形花色优美，观赏价值高；花期长，在热带亚热带适种地区花期可从5 月一直持续到11 月；种球不易发生退化现象，病虫害少，易栽培等优点，近年来作为园林花境、花坛、盆花以及鲜切花等被广泛推广应用.但当前国内姜荷花品种资源的数量较少，一定程度上限制了姜荷花的市场应用.杂交育种是选育姜荷花新品种行之有效的一种方法[1]，而杂种后代及时的甄别，去伪存真，是进行杂交育种工作的重要环节.

SSR (simple sequence repeats)即简单重复序列，是一种以特异引物PCR 为基础的分子标记技术.SSR分子标记被广泛应用于植物遗传多样性分析及育种研究.胡伟等[2]进行了姜黄属花卉种质资源表型性状分析的研究，对16 份姜黄属植物的11 个数量性状及7 个质量性状进行因子和聚类分析，毛俐慧等和Taheri等以前期高通量测序结果为基础，对转录组数据的SSR位点进行发掘和分析，研究分析了姜荷花全长转录组微卫星序列的组成，开发了姜荷花SSR 标记，且SSR 被用于研究姜荷花品种遗传多样性[3-6].这些研究为姜荷花杂种后代的鉴定及遗传多样性研究打下了坚实的基础.

分别采集来自漳州的29 份姜荷花桑巴×黄色梦幻及27 份桑巴×清迈粉杂交子代，利用SSR 分子标记技术对其进行真杂种鉴定，并开展遗传多样性分析，阐明其亲缘关系及遗传结构，为下一步进行姜荷花新品种选育提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料

所采用的样品黄色梦幻（'Siam TM Sitrone'）、桑巴（'Siam TM Samba'）、清迈粉（'Chiang Mai Pink'）、桑巴×黄色梦幻、巴×清迈粉（图1）及桑巴后代的采集来自均漳州.实验所用材料为各种质材料生长良好的健康叶片.

图1 3份姜黄属种质资源亲本及子代Fig.1 Three parents germplasms of Curcuma and offsprings

1.2 SSR及数据分析

在前人合成的84对SSR 引物[3-4]和闽南师范大学闽台特色园林植物福建省高校重点实验室开发的97对引物中筛选出了11 对条带清晰，多态性高，重复性好的SSR 引物（表1）用于56 个姜黄属种质资源的真杂种鉴定和遗传多样性分析.PCR 扩增体系为10 µL，由ddH2O 3.4 µL、正反向引物各0.3 µL、Thermo Scientific™ DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 5 µL、浓度为100 ng/µL 的模板DNA 1 µL 组成.循环步骤为：95 ℃预变性 5 min；95 ℃变性45 s，54～56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，34个循环；72 ℃总延伸5 min.用6%聚丙烯酰胺凝胶对变性PCR 产物进行电泳检测.运用PowerMarker 3.25 分析多态性信息量(polymorphism information content，PIC)[7].用MEGA 6中的邻接法进行系统发育分析[8].

表1 SSR引物Tab.1 SSR markers used in this study

2 实验结果与分析

2.1 真杂种鉴定

利用5对具有父本特征条带的SSR引物对以黄色梦幻为父本和7对具有父本特征条带的SSR引物对以清迈粉为父本的2 个杂交群体和对应亲本分别进行分子鉴定.桑巴×黄色梦幻的29 株F1 采用引物c20439、c20865、CuA51、CuA60、CuAl15 进行鉴定.引物c20439 可将25 株材料鉴定为真杂种，鉴定率为86.21%；引物c20865可将23株材料鉴定为真杂种，鉴定率为79.31%；引物CuA51可将23株材料鉴定为真杂种，鉴定率为79.31%；引物CuA60 可将26 株材料鉴定为真杂种，鉴定率为89.66%；引物CuAl15 可将26株材料鉴定为真杂种，鉴定率为89.66%.5对SSR引物鉴定桑巴×黄色梦幻的29株子代均为真杂种.

桑巴×清迈粉的27 株F1 采用引物c20865、c12365、c27068、CuA7、CuAl20、CuAl25、CuA62 进行鉴定.引物c20865可将20株材料鉴定为真杂种，鉴定率为74.07%；引物c12365可将24株材料鉴定为真杂种，鉴定率88.89%；引物c27068可将19株材料鉴定为真杂种，鉴定率为70.37%；引物CuA7可将9株材料鉴定为真杂种，鉴定率为70.37%；引物CuAl20可将22株材料鉴定为真杂种，鉴定率为81.48%；引物CuAl25可将22 株材料鉴定为真杂种，鉴定率为81.48%；引物CuA62 可将22 株材料鉴定为真杂种，鉴定率为81.48%.7对SSR引物鉴定桑巴×清迈粉的27株子代均为真杂种.

2.2 亲缘关系分析

基于GenAlEx 6.5分别计算2个桑巴姜荷花杂交组合的子代间的遗传距离，利用MEGA 6中的邻接法（Neighbor-joining）法进行亲缘关系分析，构建出系统发育聚类图(图2).桑巴×黄色梦幻杂交后代29 份姜荷花种质资源可分成两个组群，其中：红色部分为亚群1，绿色部分为亚群2.亚群1 包括9 个杂种，该9 个杂种与父母本遗传距离较近，亚群2包括20份杂种，该20个杂种与父母本遗传距离较远，这部分或产生综合父母本优良性状的新品种的可能性更高.桑巴×清迈粉杂交后代27份姜荷花种质资源可分成三个组群，红色部分为亚群1，绿色部分为亚群2，蓝色部分为亚群3.亚群1 包括9 个杂种，该9 个杂种与父本清迈粉遗传距离较近，亚群2 包含4 个杂种，该4 个杂种与母本桑巴遗传距离较近，亚群3 包括14 个杂种，与父母本遗传距离较远，这部分或产生综合父母本优良性状的新品种的可能性更高.

图2 2组姜荷花子代种质资源邻接法聚类分析Fig.2 Neighbor-joining clustering analysis of 2 groups offspring germplasm resources of Curcuma alismatifolia.

2.3 遗传多样性分析

使用PowerMaker 软件分析了桑巴后代56 份姜荷花种质资源的遗传多样性.桑巴×黄色梦幻杂交后代筛选出的引物见表2，基因多样性平均值为0.696，最高的引物为CuA60（0.807）.杂合度平均值为0.755，最高的引物为CuAl15 和CuA60（0.903）.引物多态信息含量（PIC）平均值为0.646，其中PIC 最高的为CuA60（0.781）.桑巴×清迈粉杂交后代筛选出的引物见表3，基因多样性平均值为0.744，其中基因多样性最高的为CuA7（0.797）.杂合度平均值为0.640，其中杂合度最高的为CuA62（0.828）.引物多态信息含量（PIC）平均值为0.703，最高的引物为CuA7（0.766）.筛选出的11 对引物均为高多态性引物（PIC＞0.5）.

表2 桑巴×黄色梦幻的SSR分析Tab.2 SSR analysis of 'Siam TM Samba' × 'Siam TM Sitrone'

表3 桑巴×清迈粉的SSR分析Tab.3 SSR analysis of 'Siam TM Samba' × 'Chiang Mai Pink'

3 讨论

杂交是品种选育、群体构建和重要基因定位等操作的基础.目前，杂交育种仍是新品种选育的有效手段，通过杂交重组可实现多目标性状基因的改良.但是在杂交过程中，人工操作不规范、自花授粉等原因易造成杂交后代混杂，因此对杂交后代进行早期真杂种鉴定，淘汰假杂种是植物种质创新工作中的重要环节，也能为后期其他分子标记辅助育种如指纹图谱和遗传图谱的构建等工作提供参考[9-10].种质资源收集鉴定是育种工作的基石，而种质资源的鉴定及优良基因的发现，均离不开分子标记对种质资源的遗传多样性分析.

SSR 标记技术具有操作简便、多态性高、成本较低，在种质资源鉴定和遗传多样性的研究中广泛被应用.赖小群等[11]应用SSR分子标记进行新台糖25号×云蔗89-7真杂种鉴定.田春艳等[12]利用SSR分子标记进行甘蔗野生种割手密F1 代的鉴定和遗传分析.桃汪阳等[13]应用SSR 分子标记鉴定黑麦草F1 代杂种鉴定.应用EST-SSR 标记进行花楸树和少叶花楸杂交F1 代群体的遗传关系分析和杂种鉴定[14].李洋益等[15]利用ISSR引物分子标记分析国产姜黄属植物的遗传多样性等不同标记类型以及表型分析.

本研究中应用筛选的11 对SSR 标记引物c20439、c20865、c12365、c27068、CuA7、CuA51、CuA60、CuA62、CuAl15、CuAl20和CuAl25均为高多态性引物其PIC值均高于0.5，将桑巴两个杂交组合的56个杂种鉴定为真杂种.研究结果通过亲缘关系分析和和遗传多样性分析表明姜荷花桑巴×黄色梦幻和姜荷花桑巴×清迈粉后代类群具有较高的遗传多样性.研究中使用的SSR分子标记仅能对子代进行真杂种鉴定，未能对具有育种目标性状的子代进行早期筛选和鉴定.因此，在未来的姜荷花相关研究中，可扩大研究群体的范围，选择遗传背景差异大且亲缘关系相对较远的姜荷花材料作为亲本，根据育种目标开发与目标性状相关联的分子标记，在子代早期进行鉴定和筛选，以此增加获得优势杂种以及优良性状的姜荷花新品种的几率，提高育种效率并加快育种进程.