基于西兰花尾菜为载体的解淀粉芽胞杆菌PHODG36颗粒剂研制及其对棉花黄萎病的防治效果

赵卫松，李社增*，赵明珠，郭庆港，鹿秀云，勾建军，马 平

（1.河北省农林科学院植物保护研究所/河北省农业有害生物综合防治工程技术研究中心/农业农村部华北北部作物有害生物综合治理重点实验室，保定 071000；2.河北省植保植检总站，石家庄 050031）

棉花黄萎病（cotton verticillium wilt）是由大丽轮枝菌VerticilliumdahliaeKleb.引起的土传病害。由于该病原菌能够以微菌核形式在土壤中长期存活达20 年之久，以及病原菌致病力分化多样，导致强致病力菌株上升为优势菌群，加之棉花品种抗病性存在不稳定的情况，生产上难以对其进行有效防治[1-3]。同时，在生产上棉花种植单一（尤其是在冀南植棉区），缺乏有效的轮作栽培模式，致使棉花黄萎病发展蔓延速度较快，严重影响了棉花的产量和品质。因此，针对性地开展棉花黄萎病的防治已成为生产上的迫切需求。

利用植物轮作及其残体还田是有效防治作物土传病害的途径之一[4,5]。已有研究表明，土壤添加西兰花残体能够有效降低大丽轮枝菌数量并延缓病原菌的侵染过程[6,7]、释放具有抑菌功能的次生代谢物质[8]、改变土壤微生物多样性和增加土壤中有益微生物菌群丰度[9-12]，最终有效降低作物黄萎病的发生。然而，西兰花种植受耕作制度的制约，其直接还田受到限制。据统计，2018 年我国蔬菜总产量8.17 亿吨，其产生的尾菜（新鲜蔬菜去掉的残叶，俗称为烂菜叶子）约占蔬菜总产量的51%，其在堆积腐烂过程中造成了环境的污染，为病菌和病虫害提供了繁衍生息的场所，直接对下茬和来年的蔬菜产量和品质造成影响。

利用活体微生物菌剂是有效防治作物土传病害的措施之一，但传统微生物菌剂防治作物土传病害效果不稳定成为限制其广泛应用的瓶颈问题之一。将微生物菌剂与植物残体联合施用不仅能促进作物生长，而且能提高防病效果[11]。因此，以西兰花尾菜为填料的新型微生物菌剂创制是棉花土传病害绿色防控发展的重要措施。芽胞杆菌Bacillusspp.作为重要的生防资源，具有广阔的应用前景。解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciensPHODG36 是河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室筛选到的对土传病害具有很好防治效果的生防菌株，该菌株已获得国家发明专利（专利号：ZL 201610876803.2），且以该菌株为有效成分研制的微生物菌剂对马铃薯黄萎病和疮痂病具有很好的防治效果[13,14]。因此，本研究以西兰花尾菜干粉为主要载体、菌株PHODG36 为有效成分，研制出微生物颗粒剂。对该菌剂在棉花上的应用安全性进行评价，并初步探索该菌剂用于防治棉花黄萎病的田间使用技术，为进一步推广应用该颗粒剂防控棉花黄萎病、制定田间使用技术规程提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试菌株解淀粉芽胞杆菌BacillusamyloliquefaciensPHODG36，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.13041；病原菌为大丽轮枝菌VerticilliumdahliaeWX-1，由河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室分离、纯化保存。供试作物为棉花，品种鄂荆1 号，属于感黄萎病棉花品种，用于温室盆栽试验；农大棉36 号，属于耐黄萎病棉花品种，用于田间小区试验。培养基质：从河北省保定市高阳县连续多年种植棉花地块，收集耕作层土壤，与泥炭土有机基质按照2:1 比例充分混匀，用于温室盆栽试验。

1.2 菌株活化与种子液制备

将-40 ℃保存的PHODG36 菌株转接于LB 平板培养基上，并在（30±1）℃下过夜培养，然后分别挑取单菌落接种于LB 斜面培养基上，并在上述条件下培养，之后用无菌水洗涤培养基表面，其菌悬液即为种子液（OD600=1.5）；按照体积百分比0.5%向LB 液体培养基中接入种子液，（30±1）℃、180 r/min 振荡培养24 h，得到的培养液作为制备微生物颗粒剂的PHOG36 菌株发酵液。

1.3 西兰花尾菜的收集及其加工

西兰花收获后，收集其剩余的植物组织（包括叶片和根），在自然条件下晾晒、风干，之后采用万能粉碎机（型号WF-20B，江阴市江拓机械设备有限公司）对收集的干物质进行粉碎，得到初步干物质粉末，进一步利用电热恒温鼓风干燥箱（型号DHG-9243BS-III，上海新苗医疗器械制造有限公司）烘干，通过球磨粉碎机（型号JCWF-100B，济南骏程机械设备有限公司）进行粉碎。通过圆形验粉筛（型号YYFS30，杭州大吉光电仪器有限公司）根据剩余在筛上的样品量计算出粉碎细度[15]。

1.4 微生物颗粒剂的加工工艺

将上述制备的西兰花尾菜干粉与草炭粉末（细度为300 目）按照1:0.3 比例（w/w）在SYH 三维混合机（上海尘鑫粉体设备有限公司）中充分混合均匀作为制备菌剂的填料。在搅拌状态下，分批、多次加入PHODG36 菌株发酵液，直至手握成团、不松散（填料:发酵液为1:0.8，w/v），然后将其加入至卧室造粒机进行颗粒剂的制备，制备的微生物菌剂颗粒在通风干燥条件下风干。利用平板计数法测定颗粒剂的芽胞含量。

1.5 温室盆栽评价微生物颗粒剂对棉花生长的安全性评价及促生作用

挑选均匀一致的供试棉花种子，先用75%的乙醇处理3 min，再用1%（v/v）的次氯酸钠消毒10 min，无菌水冲洗3 次，然后播种于含有颗粒剂不同浓度的花盆中（高14 cm、盆口直径17 cm、盆底直径12 cm，1 kg 基质/盆），每个花盆播种10 粒种子，作为1 个处理，每个处理3 次重复。试验设置6 个处理。处理1，培养基质中不添加颗粒剂处理，为空白对照；处理2，培养基质中添加颗粒剂质量浓度0.1%；处理3，培养基质中添加颗粒剂质量浓度0.3%；处理4，培养基质中添加颗粒剂质量浓度0.5%；处理5，培养基质中添加颗粒剂质量浓度1.0%；处理6，培养基质中添加颗粒剂质量浓度2.0%。试验期间加强棉花虫害管理，适时补充水分，每次200 mL/盆。播种15 d 后，调查不同处理的出苗情况，计算校正出苗率[7]；播种后50 和70 d 调查植株株高。播种70 d 后调查棉花植株鲜重和干重。

1.6 温室盆栽评价微生物颗粒剂对棉花黄萎病的防治效果

在1.5 明确菌剂适宜用量的基础上，通过温室试验评价菌剂对棉花黄萎病防治效果。按照赵卫松等[7]方法进行大丽轮枝菌孢子悬浮液的制备，将培养好的大丽轮枝菌分生孢子悬浮液与培养基质混合，制成分生孢子含量为106CFU/g 的基质。将颗粒剂与培养基质按照0.3:100（w/w）的比例混匀，然后将准备好的种子按照1.5 方法播种于花盆中，以不加颗粒剂的处理作为空白对照。试验期间加强棉花虫害管理，适时补充水分。播种70 d 后，参考李社增等[16]方法调查棉花黄萎病发生情况、计算病情指数和防病效果。

1.7 田间试验评价微生物颗粒剂对棉花黄萎病的防治效果

2022 年5—9 月在河北省保定市高阳县北于八村棉花黄萎病人工病圃进行田间试验，评价微生物颗粒剂对棉花黄萎病的防治效果。试验田土壤均为壤土，地势平整，水肥条件较好。播种前撒施微生物颗粒剂，试验设置4 个用量处理，分别为0、500、1000、1500 kg/667 m2，撒施后通过旋耕机整地，深翻20～25 cm，之后播种棉花（品种为农大棉36）。每个处理面积300 m2（长20 m，宽15 m），行距75 cm，株距35 cm，每个处理3 次重复，每个重复以随机选择1 m 行长的出苗总数进行调查评价出苗情况（5 月20 日），在花铃期调查棉花黄萎病的发生情况（8 月17 日），按照1.6 方法计算病情指数和防病效果，评价微生物颗粒剂对棉花黄萎病的防治效果。

1.8 数据分析与统计

利用SPSS17.0 软件，采用独立样本T 检验对试验数据进行差异显著性分析。采用Microsoft Excel 2010进行数据整理和Origin 8.0 进行作图。

2 结果与分析

2.1 西兰花尾菜干粉的制备工艺

研究结果表明，B30 万能粉碎吸尘机粉碎速度为30 kg/h，得到的初步粉状干物质的细度100%通过40目，进一步烘干并通过球磨粉碎机进行粉碎，粉碎时间15 min，其粉碎细度95%以上的干粉≥80 目，满足了本试验要求。

2.2 微生物颗粒剂的基本性状

将西兰花尾菜干粉与草炭制备的填料在搅拌状态下分批加入PHODG36 菌株发酵液，直至手握成团、不松散，确定填料:发酵液为1:0.8（w/v），制备的颗粒剂经阴凉风干后，外观为黑色、短柱状，平均直径为2 mm，长度为8 mm，含水量为4.8%，芽胞含量为1.5×109CFU/g。

2.3 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂用量对棉花出苗的影响

温室盆栽试验结果表明，培养基质中添加不同用量的颗粒剂处理对棉花出苗表现出不同程度的影响（图1）。颗粒剂用量0.1%、0.3%、0.5%、1.0%和2.0%处理的校正出苗率分别为100%、103.23%、93.55%、90.32%和80.65%，单因素方差分析表明，低用量（0.1%和0.3%）的颗粒剂处理出苗率与空白对照处理差异不显著，而随着用量增加（0.5%～2%），出苗率呈显著下降趋势。该结果表明解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂的在棉花上适宜用量范围为0.1%～0.3%。

图1 不同粒径的西兰花尾菜干粉Fig.1 Different particle sizes of dried broccoli residues powder

图2 基于西兰花尾菜为载体的解淀粉芽胞杆菌PHODG36颗粒剂的形态Fig.2 Morphology of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules based on broccoli residues as carrier

图3 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂不同用量对棉花出苗的影响Fig.3 Effect of different dosages of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on cotton emergence

2.4 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂不同用量对棉花植株株高的影响

温室盆栽试验评价了颗粒剂不同用量对棉花植株株高的影响。结果表明，颗粒剂的使用对棉花植株株高表现不同程度的促生作用。在培养50 d 时，在研究浓度范围内，不同用量对株高的促生率分别为-3.88%、14.53%、3.27%、7.74%和27.42%，其中0.3%和2%处理显著提高了棉花植株株高（图4）。在培养70 d时，不同用量对株高的促生率分别为-6.46%、5.90%、21.49%、11.88%和27.35%，其中0.5%和2%处理显著提高了棉花株高（图4）。

图4 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂不同用量对棉花株高的影响Fig.4 Effect of different dosages of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on plant height

图5 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂不同用量对棉花生物量的影响Fig.5 Effect of different dosages of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on plant biomass

2.5 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂不同用量对棉花生物量的影响

以植株鲜重和干重为评价指标，系统研究了颗粒剂不同用量对棉花植株生物量的影响。结果表明，在鲜重方面，颗粒剂不同用量对其促生率分别为-4.44%、16.38%、6.15%、-6.87%和67.03%；在干重方面，颗粒剂不同用量对其促生率分别为-12.98%、17.05%、-0.05%、-3.57%和90.99%。显著性差异分析表明，除了2%菌剂用量显著提高了植株鲜重和干重外，其他菌剂使用量处理后植株的鲜重和干重，与空白对照差异不显著。

2.6 温室盆栽评价解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂对棉花黄萎病防治效果

研究了培养基质中添加解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂（比例为0.3%）与未添加菌剂处理（空白对照）的黄萎病发生情况。结果表明，空白对照的病情指数为34.72，添加解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂处理后的病情指数为13.33，对棉花黄萎病的防治效果为61.60%（表1）。

表1 解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂对棉花黄萎病的盆栽防治效果Table 1 Control effect of B.amyloliquefaciens PHODG36 granules on verticillium wilt of cotton in pot experiment

2.7 田间小区试验评价

田间试验结果表明，在研究浓度范围内解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂对棉花出苗不存在影响（数据未列出）。在黄萎病方面，空白对照处理发病最重，病情指数为51.14；解淀粉芽胞杆菌PHODG36颗粒剂500 kg/667 m2处理的发病最轻，病情指数为16.71；解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂1000 kg/667 m2处理的发病病情指数为30.96；解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂1500 kg/667 m2处理的发病病情指数为34.63。解淀粉芽胞杆菌PHODG36 颗粒剂500 kg/667 m2对棉花黄萎病的防治效果最佳，防治效果为67.28%。

3 讨论

化学肥料和化学农药是保障粮食增产的重要因素，长期以来过量施用化学肥料和化学农药带来的负面影响，与我国农业可持续发展战略相违背[17]。国内外学者研究表明，通过微生物的防病功能和肥效功能为农业的可持续发展提供了物质基础和技术支撑，而得到广泛的关注[18]。利用生防微生物能够有效预防和控制植物病害的发生，其具有资源丰富、环保安全和不易产生抗性的特点。目前，芽胞杆菌Bacillusspp.用于防治棉花黄萎病开展了大量的研究，如李社增等[16]田间小区试验表明枯草芽胞杆菌B.subtilisNCD-2 对棉花黄萎病的平均防效为85.4%；Zabihullah 等[19]通过温室盆栽表明分离到的解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens对棉花黄萎病的平均防效为60.31%；白红燕等[20]温室试验研究表明贝莱斯芽胞杆菌B.velezensisEBV02对棉花黄萎病的最高防效为68.33%，而田间防效为37.25%。周京龙等[21]盆栽试验表明蜡状芽胞杆菌B.cereusYUPP-10 对棉花黄萎病的最高防效达到80.60%。

目前，微生物菌剂固着载体材料主要为有机高分子材料，包括天然高分子载体和合成高分子载体，但其制备步骤复杂，成本较高，载体机械强度较差，存在一定的生物毒性[22,23]。利用农业废弃物生产的有机肥作为微生物菌剂的载体已有研究报道[24]。已有证据研究表明，农作物残体中的纤维素、半纤维素和木质素，是聚合在一起的多糖分子链，其能够形成“氮化合物和芳香族化合物的缩聚物”的特点，具有一定的生理活性，其自身富含植物生长所需的氨基酸等营养成分，能够被植物吸收利用，可改善农产品的质量和品质。将微生物菌剂与植物残体联合施用不仅能促进作物生长，而且能提高防病效果[11]。目前，已有报道将植物残体简单腐熟后直接利用，而没有开展进一步深加工的研究。因此，开发基于植物残体干粉的微生物农药或菌剂研制是一个前景广阔的发展方向，有助于农业绿色高质量发展。范腾飞等[25]首次将植物孢粉作为载体加入农药控制释放系统中，开发了一种新型的绿色高效农药。本研究首次将西兰花尾菜干粉和草炭为载体，以解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens为活性成分研制的微生物颗粒剂，在温室条件下培养基质中添加颗粒剂（用量比例为0.3%）对棉花出苗率不存在显著影响，且对黄萎病的平均防效为61.6%。李艳等[26]温室试验表明施用球毛壳菌ChaetomiumglobosumCEF-082 菌剂的最适宜用量为0.5%，该浓度对棉花黄萎病的防效为43.08%。赵沛等[27]研究结果表明腐皮镰孢菌FusariumsolaniCEF373 固体菌剂按照质量浓度3%拌土后，对棉花黄萎病的温室防效为62.74%。蒲丹丹等[28]田间试验表明，简青霉Penicillium simplicissimumCEF-818 菌剂对棉花黄萎病的防效为63.73%。本研究田间试验结果表明，PHODG36 菌剂不同用量处理后均降低了黄萎病的发生，其中菌剂用量为500 kg/667 m2对棉花黄萎病的防效为67.3%，随着用量的增加并不能够提高病害防治效果。因此，综合考虑使用成本因素，明确颗粒剂用量为500 kg/667 m2。

综合分析表明，本研究研制的解淀粉芽胞杆菌颗粒剂在棉花上表现出较好的防病效果，但在推广应用过程中应综合考虑外界环境因素、防治对象的发病规律、棉花品种特性、土壤类型，尤其是微生物菌剂的使用成本及其可操作性等因素，从而开发出简单实用的田间应用技术。此外，该菌剂使用后是否改变了棉花根系分泌物的组成和含量，从而影响了土壤微生物群落结构和棉花抵御病原菌侵染的能力尚需进一步研究。