CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞在妊娠期高血压疾病中的异常表达分析*

何 花,李诗雨,高 鹰,杨 林,任 为

(湖北省妇幼保健院产科,武汉 430070)

妊娠期高血压疾病是妊娠与血压升高并存的一组疾病,发生率为5%～12%[1]。其中,子痫前期是妊娠妇女20周以后出现高血压和蛋白尿的妊娠特有全身综合征,占妊娠妇女的5%～7%,严重影响母婴健康,是导致孕产妇死亡、早产和围生儿死亡的重要原因[2]。尽管对于妊娠期高血压疾病发病机制、病因、预测及治疗手段的研究很多,但其具体发病机制至今尚未完全阐明。越来越多的研究表明,B淋巴细胞主导的体液免疫同样在子痫前期的致病机制中起着重要作用[3]。而近年来,学者们在B淋巴细胞群中发现了一类具有免疫反应负向调节作用的B淋巴细胞亚群,将其称为调节性B淋巴细胞,作为负性调节细胞,其功能主要依赖于分泌的大量抑制性细胞因子,在抑制炎症免疫反应、维持/诱导调节性T淋巴细胞功能及阻止自身免疫反应等方面均具有调节作用[4]。本研究为了提供更多CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞参与妊娠期高血压疾病的证据,拟通过检测孕妇血清CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞及其分泌的相关细胞因子白细胞介素-10(IL-10)的表达来了解其在妊娠期高血压疾病发生、发展中的作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2020年9月至2021年5月于本院就诊的孕妇信息。妊娠期高血压疾病孕妇的纳入标准:(1)孕前检查、定期产检及分娩均在本院;(2)有完整的孕期血压数据,符合《妊娠期高血压疾病诊治指南(2020)》[5]诊断标准;(3)终止妊娠前经孕妇同意采集并留存有外周血。排除标准:(1)孕前存在高血压、糖尿病、自身免疫性疾病等内外科合并症病史;(2)存在高血压家族史;(3)分娩前有其他产科并发症及合并症;(4)无完整的孕前检查、定期产检及分娩时的血压数据。最终纳入符合标准的孕妇26例,并将其分为妊娠期高血压组(15例)、子痫前期组(11例)。另选取同期正常妊娠孕妇12例作为对照组,整个孕期血压均正常,分娩前无其他产科并发症及合并症,孕前无高血压、糖尿病、自身免疫性疾病等内外科合并症病史。本研究得到了本院伦理委员会的批准([2022]IEC118号)。

1.2 方法

1.2.1取血样

在终止妊娠前,采用乙二胺四乙酸(EDTA)真空管采集3组孕妇血液,并在1 h内进行处理。

1.2.2流式细胞术检测B淋巴细胞

取100 μL抗凝血置于流式管底部;加入流式抗体CD19、CD24、CD38(每个抗体每管加5 μL),涡旋混匀后4 ℃避光孵育20 min;加入2 mL溶血素,涡旋,置于室温避光15 min;每隔5分钟观察1次,若变成透明的红色则立刻进行下一步。每管加入2 mL Stain上样缓冲液,1 100 r/min离心5 min,弃上清液;再加入2 mL Stain上样缓冲液后涡旋,1 100 r/min离心5 min,弃去上清液;加入400 μL磷酸盐缓冲液(PBS)重悬细胞,上流式细胞仪检测并分析数据。

1.2.3流式细胞术检测细胞因子

(1)制备细胞因子标准品:将1瓶冻干的细胞因子标准品小球转移至15 mL锥形离心管中,标记为最高浓度标准品(5 000 pg/mL);用2 mL Assay Diluent稀释标准品,室温平衡至少15 min;用枪头轻柔混匀标准品;取9支12×75 mm流式管,分别标记梯度稀释倍数1∶2、1∶4、1∶8、1∶16、1∶32、1∶64、1∶128、1∶256;每管加入500 μL Assay Diluent;从最高浓度标准品开始逐个加入500 μL倍比稀释液,梯度稀释标准品(从最高浓度标准品管取500 μL溶液至1∶2管,吹打混匀,随后从1∶2管取500 μL溶液至1∶4管,吹打混匀,以此类推,直至1∶256管),最后取1支12×75 mm流式上样管加入500 μL Assay Diluent作为阴性质控管(0 pg/mL)。(2)混合细胞因子捕获微球:确定样品数,混合前每种捕获微球需Vertex充分涡旋5～15 s,按照每个样品7 μL吸取适量的捕获微球,充分涡旋混匀。(3)样品孵育:充分涡旋重悬混合微球,每个实验管加入50 μL混合微球,再加入50 μL藻红蛋白(PE)标记的细胞因子检测抗体,室温避光孵育3 h。(4)上机检测:每管加入1 mL洗液清洗样品,1 100 r/min离心5 min,小心吸去或轻柔倒掉上清液,每管加入300 μL洗液重悬细胞,仪器调校完毕后尽快上机检测。

1.3 统计学处理

采用GraphPad Prism6软件进行统计分析,非正态分布计量资料以M(Q1,Q3)表示,多组间比较采用Kruskal Wallis检验,两组间比较采用Mann-WhitneyU检验;检验水准α=0.05,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 3组一般资料比较

3组年龄、孕次、产次及BMI比较,差异均无统计学意义(P>0.05),见图1。

A:3组年龄比较;B:3组孕次比较;C:3组产次比较;D:3组BMI比较。

2.2 3组CD19+B淋巴细胞的表达

3组血清CD19+B淋巴细胞百分比:对照组>子痫前期组>妊娠期高血压组,但3组间比较差异无统计学意义(P>0.05),见图2。

A:3组CD19+B淋巴细胞百分比比较;B～C:流式细胞术分析CD19+B淋巴细胞在对照组、妊娠期高血压组及子痫前期组中的表达。

2.3 3组CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞的表达

3组血清CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞百分比比较,差异有统计学意义(P<0.05);两两比较显示:对照组>妊娠期高血压组>子痫前期组,且对照组与妊娠期高血压组、子痫前期组有明显差异(P<0.05),妊娠期高血压组与子痫前期组无明显差异(P>0.05),见图3。

A:3组CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞百分比比较;B～D:流式细胞术分析CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞在对照组、妊娠期高血压组及子痫前期组中的表达;a:P<0.05。

2.4 3组血清IL-10的表达

3组血清IL-10表达水平:妊娠组>妊娠期高血压组>子痫前期组,且两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),见图4。

a:P<0.05。

3 讨 论

妊娠期高血压疾病是妊娠期特有的一组疾病,其中子痫前期以妊娠20周后出现高血压、蛋白尿和水肿为特征。子痫前期经治疗母胎状况没有改善或病情持续进展时,终止妊娠是最有效的治疗措施,因此在确定发生原因方面取得的研究进展有限[6]。目前,子痫前期的病理生理机制尚未明确,胎儿-母亲耐受性障碍和免疫稳态的改变被广泛认为是其发生的主要机制。已有大量证据表明,免疫细胞在子痫前期的发生、发展中发挥作用[7-8]。正常妊娠期间,植入后不久母胎界面出现强化的免疫浸润,以自然杀伤细胞为主(占蜕膜淋巴细胞总数的70%),其次是巨噬细胞(占20%)、T淋巴细胞(占10%～20%)和罕见的树突状细胞和B淋巴细胞[9]。其中B淋巴细胞是免疫反应的谨慎协调者,这对维持胎儿-母体的耐受性至关重要。调节性B淋巴细胞是一种具有免疫调节功能的B淋巴细胞亚型,对人体健康和疾病有多种影响,其通过各种细胞因子(如IL-10、IL-35)及细胞表面标志物的表达发挥免疫耐受和调节作用[10]。

研究发现,CD19+B淋巴细胞水平在正常妊娠或子痫前期患者中没有变化[11],这与本研究结果相似。在本研究中妊娠期高血压组孕妇血清CD19+B淋巴细胞也处于相对稳定状态。此外,本研究中妊娠期高血压组及子痫前期组孕妇CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞百分比明显低于对照组。BLAIR等[12]研究表明,人外周血中可分泌IL-10的CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞百分比最高。ROLLE等[13]发现调节性B淋巴细胞在正常妊娠的前3个月增强,可能通过产生抗炎因子IL-10抑制炎症反应,有助于妊娠耐受环境的建立。在本研究中,相较于对照组,妊娠期高血压组及子痫前期组孕妇外周血血清IL-10水平降低。

已有研究表明,调节性B淋巴细胞可能通过调节辅助性T淋巴细胞(Th)亚群Th1/Th2和Th17/调节性T淋巴细胞(Treg)细胞平衡,在子痫前期的发生中发挥作用[14]。调节性B淋巴细胞可诱导初代T淋巴细胞分化为Th1和Th17。它们还可以通过调节树突状细胞分泌细胞因子来影响Th1和Th17的分化。此外,调节性B淋巴细胞还能分泌抑制性细胞因子,如IL-10、IL-35和抑制性抗体[15]。其中,IL-10被证明在子痫前期中失调,且其表达水平在疾病活动期降低[15]。这表明子痫前期的全身炎症反应和内皮功能障碍可能与IL-10缺乏相关,并最终导致免疫调节、促炎环境和血管生成受损。临床上,靶向IL-10的治疗方法可能为子痫前期提供新的选择。

在各种子痫前期动物模型中也类似地证明了IL-10途径的失调[16-19]。此外,在子痫前期动物模型中使用重组IL-10可改善子痫前期症状,并且没有其后代发生不良反应的报道[20-21]。这为IL-10用于子痫前期治疗的可能性提供了依据。重组IL-10安全且耐受性良好,虽然在人体中的使用可能因半衰期短而受到限制,但对于IL-10水平较低的子痫前期患者,IL-10药物递送系统的研究可能具有重要意义。

综上所述,孕妇外周血CD19+CD24hiCD38hi调节性B淋巴细胞及其分泌的IL-10改变可能与妊娠期高血压的发生有关,利用围产期免疫调节特性来调节B淋巴细胞的激活和功能,可能会成为一种新的治疗方案。