肿瘤相关成纤维细胞介导免疫治疗耐药的机制研究*

黄钰莹，方明治，李敏

210001 南京，南京中医药大学附属南京中医院 肿瘤科

恶性肿瘤的生物学行为由癌细胞的内在特性和外在变量所决定［1］。肿瘤微环境（tumor microenvironment， TME）作为最关键的外在变量，其复杂的动态变化及异质性是免疫治疗效果显著差异的重要原因。肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts， CAFs）作为TME 中最主要的基质细胞，与不同的免疫细胞之间相互作用，并通过各种旁分泌机制分泌可溶性因子抑制抗肿瘤免疫反应［2］。本文基于CAFs 的异质性和可塑性，重点关注CAFs 介导免疫治疗耐药的具体机制，并分析了CAFs 作为预后生物标志物的价值，以期为靶向CAFs 治疗恢复抗肿瘤免疫反应的研究开辟新思路。

采用SPSS 19.0统计学软件处理数据，计量资料采用（±s）表示，进行 t检验；计数资料采用[n（%）]表示，进行χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

1 CAFs 的异质性

1.1 原始异质性

CAFs 是一类具有高度异质性的细胞群，其原始异质性可能取决于它来自不同的细胞前体。组织驻留的成纤维细胞以及静止的星状细胞可通过调节剂的刺激转变为CAFs。健康肝脏中处于静止状态的肝星状细胞，在肝脏受损时受TGF-β 激活，可获得肌成纤维细胞样表型［3］。有研究显示［4］，TGF-β1 可以诱导增殖的内皮细胞或上皮细胞发生间充质转化，促进成纤维细胞特异性蛋白-1（fibroblast specific protein-1， FSP1）表达，进而转变为成纤维细胞样细胞。间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSCs）是CAFs 的另一种前体细胞，被招募到肿瘤中后激活分化为CAFs。CAFs 还可以来源于脂肪细胞，EB病毒通过感染人脂肪细胞，增强脂肪酶和AMPK 代谢途径的表达，进而刺激脂肪分解，诱导脂肪细胞去分化为成纤维细胞样细胞［5］。此外，也有研究表明血管、周细胞、平滑肌细胞也可以转化为CAFs［6］。来源的多样性在一定程度上解释了CAFs 的原始异质性。不同来源的CAFs，由于保留了起源组织的部分功能，受不同的活性因子或信号调控，其分子特征表现出明显的差异性，可对肿瘤的发展产生不同的作用。进一步探讨CAFs 的起源，将为CAFs 的生物标志物、信号通路和激活机制的研究和识别提供参考依据。

1.2 表型异质性

CAFs 的表型异质性可以通过特定TME 内各种生物标志物的表达差异观察得到。几种常用的标志物可用于检测CAFs，如成纤维细胞活化蛋白、α-平滑肌动蛋白、血小板衍生生长因子受体及FSP-1 等。尽管CAFs 标志物具有多样性，但仍缺乏特异性的细胞表面标志物。为了区分CAFs 亚群，鉴定可靠且具有特异性的细胞表面标志物十分关键。

考虑到CAFs 独特的细胞起源、不同的分化阶段以及周围复杂的微环境，它的亚群及其基因特征在各种肿瘤类型中具有差异性［7］。Li 等［8］使用scRNA-seq鉴定了胃癌中4 种不同的CAFs 亚群，都表现出较强的促肿瘤活性。其中，细胞外基质CAFs（eCAFs）主要分布于远端基质区域，其特征是高表达肿瘤侵袭相关基因（MMP14，LOXL2 和POSTN），且表现出对M2巨噬细胞更强的趋化作用；炎性CAFs（iCAFs）主要分布在肿瘤腺体区域，通过分泌IL-6 和CXCL12 与T细胞相互作用，进而调节炎症反应。CAFs 是一类具有高度异质性的细胞群，不同亚型的CAFs 生物学特性通常各异，使得不同的患者在放化疗敏感性、免疫治疗反应、临床疗效及疾病预后等方面表现出巨大的差异。针对CAFs的来源以及亚型进行特异性的靶向，有助于对恶性肿瘤进行精准治疗。

1.3 功能异质性

CAFs 由不同功能的异质亚群组成，对肿瘤具有促进和抑制双向调节功能。CAFs 的促肿瘤作用已经得到了广泛的研究，如在肝细胞癌（hepatic cell cancer， HCC）中，CAFs 分泌的趋化因子CCL5 通过与特定受体结合，抑制缺氧诱导因子HIF1α 的泛素化和降解，从而上调ZEB1，并诱导上皮-间充质转化，促进肿瘤进展［9］。也有研究显示［10］，CAF 分泌的外泌体circEIF3K 通过miR-214/PD-L1 轴促进了结直肠癌的进展。这也进一步提示靶向CAFs分泌的细胞因子、外泌体及其下游通路可能会增强肿瘤的治疗效果。此外，以往的研究也观察到CAFs 存在着肿瘤抑制作用，Hu 等［11］根据非小细胞肺癌中HGF 和FGF7 的不同表达水平，将CAFs 分为三种亚型，其中III 型CAFs（低HGF/低FGF7）可以促进T 淋巴细胞和单核细胞向肿瘤内募集，从而逆转免疫检查点抑制剂的耐药性。在ER＋乳腺癌中，CD146＋CAFs 可以维持乳腺癌细胞中ER 的表达，提高他莫昔芬对乳腺癌细胞的敏感性［12］。CAFs 肿瘤抑制功能的发现也进一步提示了区分亚群的重要性。值得注意的是，CAFs 存在着可塑性，由于TME 中各种成分复杂的相互作用，其可在肿瘤促进或肿瘤抑制表型之间动态及可互换的转移。诱导CAFs 获得肿瘤抑制表型可能为靶向CAFs提供新的方向。

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CAFs 通过产生胶原蛋白、纤连蛋白、MMPs 以及激活FAK 信号通路重塑细胞外基质来促进免疫抑制。CAFs 通过分泌大量胶原、纤维蛋白等促进细胞外基质（extracellular matrix， ECM）固化，产生的大量ECM 以及增加的间质液压力使得CD8+T 细胞难以向肿瘤内部渗入［35］。基质细胞通过排除T 细胞，限制了T 细胞在肿瘤细胞中积累的能力，在空间上阻碍了T 细胞浸润及其与肿瘤细胞的互作。研究显示使用赖氨酰氧化酶抑制剂降低小鼠的肿瘤硬度，增加了肿瘤浸润T 细胞的数量并且改善了对抗PD-1 治疗的反应［36］。胶原蛋白可以调节巨噬细胞的功能，高胶原密度促进巨噬细胞的M2 极化，同时也可以直接下调T 细胞的毒性活性，降低免疫治疗的疗效［37］。MMPs 可以促进正常ECM 结构的降解，促进癌细胞侵袭和转移［38］。一项胰腺肿瘤研究证明，FAK 作为ECM 信号传导的关键细胞内效应器，激活的FAK 可以增加肿瘤的迁移和侵袭能力，驱动ECM 重塑和CAFs 沉积，并且促进M2 巨噬细胞极化和募集［39］。此外，CAFs 产生的ECM 会进一步加剧缺氧的状态，间接调节抗肿瘤免疫反应。总之，CAFs 重塑的ECM 可以调控免疫细胞的活动和功能，有助于免疫抑制微环境的形成。

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2 CAFs 介导免疫治疗耐药的机制

免疫治疗已成为肿瘤治疗的主要手段之一，但耐药成为当前制约免疫治疗的一大瓶颈，导致其临床获益有限。靶向TME 中对免疫耐药起关键作用的免疫抑制性细胞是当前治疗的一个新思路。CAFs 的异质性和TME 的复杂性决定了CAFs 介导的免疫微环境的复杂性。CAFs 可以通过多种途径介导免疫微环境的改变，调节肿瘤的生物学行为，在免疫治疗耐药中起着重要的作用。然而，CAFs 促进肿瘤免疫耐药的机制研究尚不够深入。阐明CAFs介导免疫治疗耐药的主要机制，为今后精准制定逆转免疫治疗耐药的高效策略提供理论依据，是当前肿瘤免疫治疗领域亟需解决的关键问题。

2.1 促进免疫抑制细胞的募集和分化

2.1.1 CAFs 募集肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages， TAMs）并诱导促肿瘤表型 TAMs具有高度的异质性和可塑性，由不同的极化细胞因子激活，可以分为两个功能类别：经典活化的巨噬细胞（M1）和替代活化的巨噬细胞（M2）［13］。M2 巨噬细胞代表了实体瘤进展和转移的关键促进力。CAFs 通过分泌过多的可溶性介质，促进单核细胞的募集并分化为促肿瘤巨噬细胞亚群，进而抑制T 细胞的增殖并表现出更突出的免疫抑制。例如，在三阴性乳腺癌中，CAFs 通过调控CXCL12-CXCR4 轴，将单核细胞重编程为免疫抑制性的脂质相关巨噬细胞（lipid-associated macrophages， LAMs），从而抑制了T 细胞的活化和增殖，通过对这一LAMs 亚群的基因进行耗竭，可以抑制肿瘤的生长［14］。这一发现为减少乳腺癌的免疫抑制提出了一种潜在的靶向策略。Li 等［15］发现，CAFs 分泌的IGFBP7 通过调控FGF2/FGFR1/PI3K/AKT 轴促进巨噬细胞向M2/TAM表型极化。IGFBP7 在多种肿瘤中表达上调，其在肿瘤生成中复杂的生物学作用和分子机制仍然是目前关注的焦点。同样的，M2/TAM 也调节CAFs 活化［16］。活化的CAFs 进一步增强了TAM 的活性，从而构成了免疫抑制的加强循环。

2.1.2 CAFs 参与肿瘤相关嗜中性粒细胞（tumor-associated neutrophils， TANs）的募集与分化 在肿瘤早期形成阶段，TANs 通过增加细胞毒性、刺激适应性免疫系统、调控自身迁移能力等发挥抗肿瘤的作用；在肿瘤晚期形成阶段，TANs 通过释放胞外诱捕网、抑制免疫反应以及产生细胞因子、蛋白酶等衍生物起到促肿瘤转移的作用。CAFs 能够诱导TANs的募集与分化，在HCC 中，Song 等［17］发现，一方面，CAFs 衍生的CLCF1 增加了肿瘤细胞中CXCL6 和TGF-β的分泌，以旁分泌的方式促进TANs 浸润和极化，另一方面，肿瘤细胞分泌CXCL6 和TGF-β 激活CAFs 的ERK1/2 信号传导，以促进CLCF1 的产生，从而形成正反馈回路，加速诱导肝癌细胞干性和TANs“N2”极化。该研究结果可能支持CLCF1 作为潜在的预后生物标志物，并表明选择性阻断CLCF1或ERK1/2 信号传导可以为肝癌患者提供有效的治疗靶点。另外一项关于HCC 的研究中，CAFs 通过SDF1a/CXCR4 途径将外周血嗜中性粒细胞招募到HCC 中，其释放的IL6 通过JAK-STAT3 信号通路诱导TANs 分化为PDL1+TANs，从而抑制T 细胞的活性［18］。由此可见，CAFs 介导TANs 的活化为肿瘤免疫治疗提供了一种新机制。

2.1.3 CAFs 诱导骨髓来源抑制性细胞（myeloid-derived suppressor cells， MDSCs）浸润和产生 MDSCs 是未成熟骨髓细胞的多样化群体。在病理情况下，未成熟的髓系细胞往往分化受阻，功能失调。在实体瘤患者中，MDSCs 水平与治疗效果密切相关。CAFs 通过分泌各种细胞因子和趋化因子，促进MDSCs 的迁移和产生，对获得性免疫和固有免疫均发挥抑制作用。有学者发现，肺鳞状细胞癌来源的CAFs 通过分泌CCL2，促进CD14+CCR2+单核细胞向局部TME 迁移，然后诱导单核细胞重编程为MDSCs，MDSCs 通过上调NOX2 和IDO1 的表达产生过量的ROS，同时发现CD8+T 细胞的增殖受到了抑制，从而引发免疫耐受［19］。这也提示我们有效地清除过量的ROS 可能会改善T 细胞反应。最近一项关于食管鳞状细胞癌的研究观察到，CAFs 分泌IL-6 和外泌体miR-21，通过共激活STAT3 信号通路来诱导M-MDSCs 的产生，同时使得树突状细胞（dendritic cell， DC）和巨噬细胞功能缺陷，不能有效激活抗肿瘤免疫，进而促进肿瘤细胞的耐药性［20］。这些数据强调了靶向IL-6/miR-21-STAT3 轴以逆转耐药性的潜在机会。

通过筛选CAFs 相关的差异表达基因，提供新的生物标志物，有助于根据TME 差异对肿瘤患者进行分类，进一步明确不同亚型的患者在治疗效果和预后上的差异。根据这些新的生物标志物制定精准化治疗方案，可以提高患者治疗的有效率，进而提高患者生存率，具有较好的应用前景。

2.2.2 CAFs 抑制自然杀伤细胞（natural killer， NK）介导的抗肿瘤免疫 在人类实体瘤中，NK 细胞的抗肿瘤活性受到了极大的损害。这主要是由于NK 细胞在肿瘤内浸润率低以及NK 细胞功能障碍。CAFs 可通过多种机制直接或间接的对NK 细胞抗肿瘤免疫产生抑制作用。其一，CAFs 通过下调其激活受体/受体相关配体的表达来降低NK 细胞的活性和功能。研究发现，脊髓灰质炎病毒受体（PVR/CD155）是激活NK 受体DNAM-1 的配体，CAFs 可以通过下调细胞表面的PVR 来减少与DNAM-1 的相互作用，从而抑制NK 细胞的杀伤活性［27］。其二，CAFs通过分泌