人内源性逆转录病毒K 及其在乳腺癌诊断、治疗和预后中的研究进展*

朱玲玲，李婷媛，赵宇倩，余小平，陈汶

610500 成都，成都医学院 公共卫生学院（朱玲玲）；610041 成都，四川省肿瘤临床医学研究中心，四川省肿瘤医院·研究所，四川省癌症防治中心，电子科技大学附属肿瘤医院 科研处（朱玲玲、赵宇倩、陈汶），实验研究部（李婷媛）；610106 成都，成都大学 基础医学院（余小平）；100021 北京，国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院 流行病学室（陈汶）

乳腺癌是全球常见的恶性肿瘤，2020 年，乳腺癌已超过肺癌成为全球癌症发病率第一的肿瘤，新增病例达230 万，占所有癌症新发病例的11.7%［1］。由于乳腺癌早期症状和临床表现不明显，导致很多患者发现时疾病已处于晚期阶段，死亡率较高，所以早期发现、早期治疗显得尤为重要，可以降低乳腺癌患者的死亡率和改善预后［2］。目前临床上常用的乳腺癌筛查方法如乳房X 光摄影、磁共振成像等存在敏感度、特异度低，且价格昂贵、耗时长、辐射水平高、过度诊断等局限性［3-5］。因此，越来越多的研究关注分子生物标志物检测的临床作用，如癌症风险评估、诊断、预后、治疗等，并认为其可能是肿瘤早期防治的更好选择［6-7］。传统的生物标志物，如糖类抗原15-3（carbohydrate antigen 15-3， CA15-3）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen， CEA）、雌激素受体（estrogen receptor，ER）、人表皮生长因子受体（human epidermal growth factor receptor-2，HER2）等，敏感度和特异度均欠佳，且与特定肿瘤的特异相关性较低［8］。因此，探索更优的乳腺癌生物标志物具有重要意义。

人类内源性逆转录病毒（human endogenous retrovirus，HERV）是在数百万年前由外源性逆转录病毒引起的生殖细胞感染，继而整合进入人基因组的产物。其中HERV-K 是保留最完整、转录活性最高的家族，被证明与多种疾病相关，可能参与肿瘤的发生发展，是近年来研究最为广泛的HERV 家族之一。多项研究表明，HERV-K 在乳腺癌的早期检测、进展、预测转移和预后中占据重要地位，同时具有成为乳腺癌免疫治疗靶点的潜力［9-11］。综上，本文将重点探讨HERV-K 的生物学功能及其作为生物标志物在乳腺癌中的潜在应用，为乳腺癌早期筛查分子标志物的选择提供新视角。

1 HERV 的结构、分类和生物学功能

HERV 约占人类基因组的8%［12］，是人类祖先的生殖细胞系感染外源性逆转录病毒后，整合入人类基因组，形成稳定的基因片段，并垂直遗传给后代的产物［13］。此前一直被认为是退化的遗传因素，直至1981 年被首次发现［14］。尽管针对HERV 的研究已有数十年，当前人类基因组中完整的HERV原病毒分类、功能仍未被全面分析。HERV 与外源性逆转录病毒的典型前病毒结构相似（图1），通常由两个长末端重复序列（long terminal repeats，LTR）和中间gag（如衣壳和核衣壳）、env（如信号肽、包膜表面）、pro（如参与病毒生命周期的蛋白酶）、pol（如逆转录酶和整合酶）四个开放阅读框（open reading frame，ORF）组成［13］。HERV LTR 在人类基因组中广泛分布且遗传具有不稳定性，它们在人类染色体上是非随机分布的，并与基因密度有关［15］。

图1 HERV 的结构示意图Figure 1.Structure of HERV

根据序列同源性［16］HERV 被分为3 大类：（1）Class Ⅰ家族，又称类γ反转录病毒，包括 HERV-T、HERV-I、HERV-H、HERV-W、ERV-9 等；（2）Class Ⅱ家族，又称类β反转录病毒，主要成员是HERV-K超家族，目前已知由11 个亚群（HML1-11）组成，其中，HML-2 与小鼠乳腺瘤病毒（mouse mammary tumor virus，MMTV）存在密切联系，又名人鼠乳腺瘤类病毒［17］；（3）Class Ⅲ家族包括 HERV-L、HERV-L32、HERV-S 等。

既往研究表明，HERV 具有沉默、转录调控，参与人类胚胎发育等多种生物学功能。作为逆转录转座子（transposable elements，TE）的一类，内源性逆转录病毒（endogenous retrovirus，ERV）通过复制粘贴机制被整合进入基因组，并具有沉默和转录调控的作用［18］。其次，HERV-K LTR 序列在不同位点之间存在差异，这种差异会导致不同细胞类型中的不同病毒表达发生变化。研究表明［19］，约1/3 的p53 蛋白结合位点在ERV 的LTR 中富集，在1 509个HERV LTR 区域中，约有31 万个几乎完美的p53 DNA 结合位点，ERV p53 位点可能参与p53 基因调节和转录。许多证据表明［20-22］，ERV 参与哺乳动物胎盘，通过整合进入哺乳动物的基因组后在生物系统中起作用，促炎细胞因子干扰素-γ（interferon gamma，IFNG）的转录网络的形成可能与ERV 相关。Grow 等［23］在人类胚泡中检测到HERV-K 病毒样颗粒和Gag 蛋白，证明人类早期发育是在逆转录病毒产物存在的情况下进行的。ERVs 在人类早期发育过程中发挥抵御病毒入侵的作用，并表现出独特且复杂的表达模式。

2 HERV-K 的可能的致癌机制

据估计［15］，每单倍体人类基因组中约含30~50个HERV-K 前病毒，总共有约1 000 个HERV-K 拷贝数。与其他HERV 家族不同的是，HERV-K 保留了更加完整的ORF，具有较多的编码能力，是HERV中最年轻、最活跃的家族，类似于β外源性逆转录病毒家族转录活跃，参与多种肿瘤的癌变，是目前国内外研究的热点。

2.1 染色体重排

HERV 原病毒可能造成基因不稳定，癌症起源于癌基因的异常表达和抑癌基因的失活。5’LTR 和3’LTR 存在序列的相似性，可能发生同源重组，而HERV 等重复序列元件可能通过远处位点之间的同源重组导致染色体重排。一项序列分析研究表明［24］，部分HERV-K 基因位点可发生大规模的染色体重排和易位，从而导致人类基因组进化过程中前病毒的缺失，影响细胞基因的活性从而促进癌症的发生。一项关于前列腺癌的研究发现［25］，染色体重排会导致一种转录因子（E-twenty-six transformation-specific variant 1，ETV1）与HERV-K 22q11.23 位点的LTR 融合，导致截短的ETV1 异常过度表达，这种基因组调控元件的改变可能与前列腺癌发展机制有关。

2.2 促进细胞增殖

与HERV-K 编码有关的衍生蛋白，如Np9、Rec、Env 有助于细胞增殖，被认为可能与癌症相关。Chen 等［26］发现 Np9 不仅能激活细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）、蛋白激酶B（protein kinase B， PKB）和跨膜受体蛋白（notch receptor 1，Notch1）信号通路，还可以上调β-连环蛋白，促进髓系和淋巴母细胞白血病细胞的生长。在乳腺癌、卵巢癌和白血病［26］等肿瘤组织中也能检测到Np9。Lemaitre 等［27］研究表明HERV-K Env 本身也具有致癌特性，其在非绒毛形成性人乳腺上皮细胞系中的表达诱导上皮至间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），这通常与肿瘤侵袭性和转移有关。

2.3 参与免疫调节

在癌症发展过程中，HERV 家族对机体免疫系统的调节可能发挥双重作用：致癌和抗癌［28］。一方面，HERV 的免疫抑制功能可以降低肿瘤细胞的免疫识别，从而促进癌症的发生。研究表明［29］，从人畸胎瘤细胞系释放的HERV-K 颗粒、重组Env 跨膜蛋白（transmembrane protein，TM）和其TM 蛋白对应结构域的合成肽能够抑制人类免疫细胞增殖，诱导调节多种细胞因子的表达。HERV-K Env 蛋白可以通过激活ERK1/2 通路和诱导迁移，促进EMT，从而在肿瘤的发生中发挥作用［29］。

另一方面，HERV 通过免疫激活可以抑制癌症的发展，先天免疫受体对病毒侵入的感知能促进促炎因子的产生，迅速建立抗病毒状态。这种免疫激活过程有助于控制感染，为由T 淋巴细胞和B 淋巴细胞介导的适应性免疫反应做准备，从而引发特定的细胞和体液免疫。HERV 的免疫原性与其在癌症组织中表达的显著上调相结合，可能是未来肿瘤治疗的创新靶点［30］。DNA 甲基转移酶抑制剂（DNA methyltransferase inhibitors，DNMTIs）可 以 降低DNA 甲基化水平，从而激活在肿瘤中沉默的基因，DNMTIs 对基因组去甲基化也可能导致ERV 的上调和双链RNA 的产生，而逆转录病毒RNA 与抗病毒应答基因的激活有关。Wolff 等［31］提出，去甲基化药物（hypomethylating agents，HMA）的核心机制是逆转肿瘤细胞中的异常甲基化，重新激活CpG岛（cytosine phosphoric acid guanine）启动子，导致肿瘤基因的再表达，这个机制可以使表观遗传沉默的ERV 元件诱导干扰素反应来影响肿瘤免疫，表明低剂量的HMA 具有作为各种肿瘤类型的新治疗方案的潜力［32-35］。因此，ERV 作为致癌的驱动因素，也可能有助于癌症的免疫治疗［36-38］。

3 HERV-K（HML-2）在乳腺癌防治中的作用

近半个世纪以来，不同乳腺癌亚型的靶向治疗方法取得巨大进展，但乳腺癌的预防和早期发现仍需探索［39］。HERV-K 由11 个亚组（HML-1 到HML-11）组成，其中一些HML-2 原病毒具有人类特异性和多态性，是最活跃的逆转录病毒家族。因此，HML-2 被认为是研究潜在致癌活性方面最有价值的HERV-K 亚组。1986 年研究发现［17］，HERV-K 的env 基因产物在结构上与MMTV env 蛋白相似，同时提出HERV-K env 基因在人乳腺癌细胞中也有可能表达。次年，该团队用女性类固醇激素刺激人类乳腺癌细胞系发现会导致HML-2 mRNA33 的显著上调［40］，为后续HERV-K 在乳腺癌中的功能作用奠定了基础。

3.1 HERV-K 作为乳腺癌的早期和预测转移的生物标志物

HERV-K 在癌细胞中的显著表达为乳腺癌的诊断和早期预测提供了潜在的生物标志物工具。研究显示［10］，与健康组织相比，乳腺癌细胞系和患者组织中多个HERV 家族的mRNA 和蛋白质过表达。一项研究表明［41］，HML-2 的mRNA 和蛋白质水平在乳腺癌患者的血液中显著上调。Wang-Johanning等［11］发现，患有原位导管癌和I 期乳腺癌的女性血清HML-2 mRNA 和HERV-K 抗体滴度显著高于未患癌女性，其受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线下面积（area under the curve，AUC）为0.89，与乳腺X 线检查的AUC 相当，HERV-K 作为早期乳腺癌血清标志物的敏感度较高。同时，该团队还发现患有原发性乳腺癌且3~4年内发生转移的患者的血清HML-2 mRNA 往往高于未发生肿瘤转移的患者。另一项观察研究中［42］，223 例原发性乳腺癌患者中有66%可检测到血清HERV-K，与HERV-K 阴性相比，其淋巴结转移率更高。证明在乳腺癌早期，患者血液中的HERV-K（HML-2）抗体和mRNA 已经升高，且发生转移的风险更高。最近的一项研究［43］综合分析多数据集的HERV-K 前病毒表达谱，发现其在乳腺癌患者的乳腺组织中的表达均高于健康人。同时，该研究首次发现，位于肿瘤蛋白p53（tumor protein p53，TP53）中的17p13.1 前病毒表达可以调节TP53 在ER +和HER2 + 乳腺癌中的表达。一项针对HERV-K 对乳腺癌的分子研究发现，用短发夹RNA（short hairpin RNA，shRNA）env 敲低HERV-K 的表达，可以阻断乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，减弱了乳腺癌细胞形成肿瘤的能力，并显著减少转移，证明了HERV-K Env 蛋白在乳腺癌的发生和转移中起到了重要作用。

3.2 HERV-K 作为乳腺癌预后标志物

HERV-K-T47D-RT 是从经过激素治疗的人乳腺癌细胞系中分离的逆转录酶（reverse transcriptase，RT）cDNA。Golan 等［44］为 了 评 估HERV-K-T47DRT 在人类乳腺肿瘤中的表达，对110 例乳腺癌活检石蜡切片染色进行共聚焦分析，发现HERV-KT47D-RT 的过度表达与乳腺癌患者的不良预后及其总体生存率显著相关。一项研究分别对美国195 例患者和中国110 例患者的石蜡包埋乳腺肿瘤组织中的env 蛋白表达进行了免疫组织化学评估［45］，在两个人群中均观察到HERV-K env阳性率与肿瘤大小、TNM 分期和淋巴结转移显著相关。对中国乳腺癌患者随访发现，HERV-K 血清高表达的患者总体生存率明显降低，这与在肿瘤活检组织中的研究结果保持一致。既往研究显示［46］，HERV Rec 和Np9 蛋白和一些特异性抗体在肿瘤细胞中频繁过度表达，可作为肿瘤诊断和治疗的预后和治疗性生物标志物。

3.3 HERV-K 与乳腺癌免疫治疗

HERV-K 已被多项研究表明具有乳腺癌靶向治疗的潜力。Wang-Johanning 等［42］使用抗HERV-K env 单克隆抗体靶向调控HERV-K 的表达，并通过体外乳腺癌细胞的生长、凋亡和异种移植瘤小鼠体内肿瘤生长来评估其抗肿瘤效果，可观察到抗HERV-K 特异性单克隆抗体能抑制乳腺癌细胞的生长并诱导其凋亡。同时，与对照组治疗的小鼠相比，使用6H5 单克隆抗体（6H5 monoclonal antibody，6H5mAb）治疗的小鼠异种移植肿瘤的生长和重量显著降低。另一项研究发现［47］，使用HERV-K env蛋白的特异性嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor，CAR）对人正常乳腺上皮细胞（Michigan Cancer Foundation-10A，MCF-10A）无细胞毒性，但对乳腺癌细胞呈显著的细胞毒性。此外，接受K-CAR 治疗后的小鼠发现其乳腺肿瘤中的HERV-K 表达的下降与TP53 的上调、双微体同源基因2（mouse double minute 2，MDM2）和p-ERK 的 下 调 显 著 相 关［47］。Jin 等［48］研究显示，HERV 衍生的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）在三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）中呈高表达，其在小鼠体内靶向该lncRNA 可以抑制TNBC 的进展并减小肿瘤大小，提示HERV LncRNA 可以作为TNBC的潜在的治疗靶点。另外，Sheng 等［49］研究发现，通过基因或药物消融组蛋白去甲基化酶（lysine-specific demethylase，LSD1），可以刺激HERV 的表达使其增强肿瘤免疫原性，而LSD1 表达与人类各种癌症中的细胞毒性T 淋巴细胞（cytotoxic CD8 T cells，CD8 T）浸润呈负相关，包括HERV-K 在内的许多逆转录病毒都具有免疫抑制特性，研究表明，HERV-K Rec 已被证明与β-连环蛋白相互作用［50］，从而诱导对肿瘤的免疫耐受。因此HERV-K 蛋白及其转录本被认为可能是几种癌症类型治疗的潜在靶点。

4 HERV-K 在不同肿瘤中的作用

目前的研究表明，HERV-K 可以在各种组织中产生转录物，其过度表达可在多种类型的肿瘤中被检测到，如黑色素瘤［32］、前列腺癌［33］、卵巢癌［34］和乳腺癌［10］等。Rezaei 等［35］研究发现，在前列腺癌患者的组织中，前列腺恶性组织中HERV-K Gag 的表达显著高于良性组织，有85.2%的前列腺癌患者组织中的HERV-K Gag RNA 上升，他们认为HERV-K Gag RNA 和蛋白的高表达可能是前列腺癌的敏感生物标志物，为临床诊断提供潜在用途。在胰腺癌患者中的研究发现［36］，患者血清中HERV-K 病毒RNA 水平和抗HERV-K 抗体滴度显著高于正常人血清，靶向HERV-K env 的shRNA 可以观察到3 种胰腺癌细胞系和小鼠体内肿瘤生长率呈显著降低趋势，并且治疗后肺转移比例减少。这些数据表明，HERV-K 在胰腺癌的发生和进展中也有潜在重要作用，可能是胰腺癌早期检测、诊断和免疫治疗的潜在靶点。Steiner 等［37］利用最近新开发的生物信息学工具鉴定HERV 在癌症基因组图谱中的差异表达，发现在前列腺癌、乳腺癌和结肠癌中均有155 种HERV 差异表达，为未来研究HERV 在癌症中的功能作用奠定了基础。多项研究证明HERV-K 存在多种类型的肿瘤中，参与肿瘤的发生发展，但其关联尚未完全阐明，与肿瘤的发病机制是存在因果关系或辅助作用尚存在争议，有待进一步研究探讨［38］。

5 HERV-K 的实验室检测方法

人内源性逆转录病毒的常用检测方法有酶联免疫吸附测定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、反转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）等，反映了不同水平的基因活性。

ELISA 是一种用抗原抗体特异性结合进行免疫反应的定性和定量检测方法。ELISA 检测血清中的自身抗体有助于早期肿瘤患者的发现进行辅助诊断、观测预后情况等优势，也存在所需的抗体等材料制备困难、价格昂贵等局限性［51］。有研究使用ELISA 测定抗HERV-env 蛋白的血清抗体滴度，以检测人类血清中的抗HERV 抗体，证明HERV-K mRNA 和蛋白质（如Rec 和Np9）是早期乳腺癌的候选血清生物标记物［11］。另外，ELISA 检测同样可用于逆转录病毒的检测和定量分析。一项针对HERV-Kp27 CA 蛋白开发的AC-ELISA 检测方法可用于评估畸胎瘤细胞系中HERV-K（HML-2）的表达并且具有较高的敏感度、特异度［52］，为肿瘤实验室检测提供了新的方法和思路。

RT-PCR 是通过内参或外参法对待测样品中的特定DNA 序列进行定量分析的方法，检测所需时间短、在微量检测中占据优势，可用于肿瘤标志物及肿瘤基因检测从而辅助肿瘤疾病的诊断，是今年来微量病毒检测的主要手段，在研究早期阶段，Ejthadi等［53］开发了一种可以在细胞系中观察到HERV-K的新型多重RT-PCR 系统，并通过试验表明RT-PCR与Southern 印迹杂交法相结合，可以从乳腺癌组织中检测到HERV-K，认为这是检测癌细胞系和组织中的HERV-K 表达水平的新方法。然而，RT-PCR对于基因检测的高敏感性可能造成即使是轻微的DNA 污染也会导致不良结果，造成假阳性。

目前HERV-K 的临床检测暂无标准操作程序、国内外相关文献较少、临床检测技术还非常不成熟，具有一定局限性，限制了HERV-K 与乳腺癌之间相关性的深入探索及临床应用研究。

6 总结与展望

过去HERV 一直被认为是无用的基因序列，伴随着生物医学的快速发展，HERV 已被证明与多种癌症有关。虽然HERV 与癌症发生的直接联系还未被证实，它们的存在仍然对肿瘤新型生物标志物的应用十分有利。尤其是HERV-K 家族被多项研究使用RT-PCR、ELISA 等方法证明其在乳腺癌的诊断、治疗和预后［11，42，45］中具有应用前景，为乳腺癌的研究提供了新思路和新方法。然而，既往大多数研究是在细胞、动物、人体血清实验中证明HERV-K在乳腺癌中的功能作用，HERV-K 作为乳腺癌的新型标志物还处于研究阶段，尚缺乏开发快速、高效和标准化的HERV-K 的临床检测方法及前瞻性的人群研究证明其临床应用中的可行性，未来需开展大规模多中心的前瞻性研究加以证实。

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