熊果酸调控MAPK 通路对肢体缺血再灌注肝损伤大鼠的影响

杨小春，吕建，孙景毅，汪文月，王媛媛

（1.河北港口集团有限公司港口医院消化科，河北 秦皇岛 066000；2.河北港口集团有限公司港口医院消化内镜中心，河北 秦皇岛 066000；3.河北省沧州市中心医院肾病血液净化科，河北 秦皇岛 061000；4.河北港口集团有限公司港口医院心内科，河北 秦皇岛 066000；5.北京大学第三医院秦皇岛医院消化科，河北 秦皇岛 066000）

肢体缺血再灌注不仅会引起局部缺血组织损伤，而且也容易导致远隔器官组织损伤，其中肝脏是易受累器官之一[1]。肢体缺血再灌注引起的远隔组织器官损伤的机制十分复杂，目前多数学者认为氧化应激与其具有密切关系[2]。临床研究表明，布托啡诺可通过抑制氧化应激反应有效减轻下肢骨科手术患者使用止血带所造成的缺血再灌注损伤[3]。银杏叶提取物注射液降低肢体缺血再灌注损伤患者氧化应激反应，从而改善缺血再灌注引起的肺损伤[4]。熊果酸，又名乌索酸，乌苏酸，是存在于多种天然植物中的一种五环三萜类化合物，在心肌、肝脏等组织器官缺血再灌注损伤中的作用多有报道[5-6]。然而，熊果酸是否在肢体缺血再灌注引起的远端器官损伤中发挥作用鲜有报道。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase pathway，MAPK）信号通路是重要的信号转导通路，与多种生理病理过程有关，研究表明，重组人脑利钠肽通过抑制p38 MAPK 通路降低氧化应激反应，具有减轻心肌缺血再灌注损伤的作用[7]。此外，熊果酸通过抑制p38 MAPK 信号通路可抑制Huh-7 细胞增殖，诱导细胞凋亡[8]。因此，本研究探讨熊果酸是否能通过调节p38 MAPK信号通路降低氧化应激反应和细胞凋亡，从而保护肢体缺血再灌注引起的肝损伤。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康清洁级雄性SD 大鼠50 只，8 周龄，体质量180~200 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号：SCXK（京）2021-0011。饲养期间大鼠自由饮食饮水，室内温度（22±2）℃，空气湿度50%~60%，12 h明暗交替。该研究经本院实验动物伦理委员会审批（2021111501）。

1.2 试剂和仪器

熊果酸（质量分数>98%）购自上海源叶生物科技有限公司（批号：B21403）；MAPK 信号通路激活剂茴香霉素（anisomycin）购自上海碧云天生物科技有限公司（批号：SC0132）；HE 染色试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司（批号：G1120）；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所（批号：G002-1-2）；谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）以及乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒购自上海原鑫生物科技有限公司（批号：YX-SH-A0093、YX-SHCA092、YX-SH-A0144）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）和丙二醛（MDA）试剂盒购自上海科艾博生物科技有限公司（批号：CB10431-Hu、CB10643-Hu、CB10401-Hu）；兔抗鼠p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK、ERK 抗体购自美国Abcam公司（批号：ab211061、ab308333、ab192591、ab32537）；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自美国ThermoFisher 公司（批号：31470）；AS-800 全自动生化分析仪购自南京颐兰贝生物科技有限公司；1704150 型蛋白转膜装置购自美国Bio-Rad 公司；BX51 型光学显微镜购自日本Olympus公司。

1.3 模型制备与分组给药

将50 只雄性大鼠按照随机数字表法分为正常对照组、模型组、熊果酸组、激活剂组和熊果酸+激活剂组，每组10 只。熊果酸组大鼠于造模前一周开始灌胃80 mg/kg[9]熊果酸混悬液（生理盐水配制），1次/d，连续7 d；激活剂组大鼠于造模前一周腹腔注射anisomycin 2 mg/kg[10]，1 次/2 d，共注射3 次；熊果酸+激活剂组大鼠80 mg/kg 熊果酸混悬液灌胃，1 次/d，连续7 d，同时腹腔注射anisomycin 2 mg/kg，1次/2 d，共注射3次；模型组和正常对照组大鼠分别灌胃等容量的生理盐水。于末次给药2 h 后，建立肢体缺血再灌注肝损伤模型。除正常对照组外，其余组大鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，固定于鼠板上，双侧后肢脱毛，根部环扎橡皮筋夹闭，阻断血流4 h，当观察到大鼠趾掌处颜色变苍白，且皮温发凉时模型制备成功[11]，之后松开橡皮筋持续灌注血流4 h，正常对照组大鼠仅在双后肢根部挂绕橡皮筋，不阻断血流。

1.4 ELISA法检测肝损伤指标

再灌注完成后，颈椎脱臼法将大鼠处死，取腹腔静脉血5 mL于抗凝管中，3 000 r/min离心10 min，取上清液为待测样品。严格按照ELISA 试剂盒说明书进行操作，计算ALT、AST和LDH含量。

1.5 氧化应激指标检测

采血完成后，冰上迅速剥离大鼠肝组织，取适量组织置于EP 管中，加生理盐水，剪碎，匀浆，3 000 r/min 离心10 min，取上清液，严格按照试剂盒说明书测定组织中SOD、MDA和GSH-Px活性。

1.6 肝组织HE染色

取部分肝组织，置于4%（φ）多聚甲醛中固定，脱水，包埋，切片，二甲苯透明，梯度乙醇脱水，伊红染液染色，苏木素染液染色，中性树胶封片，显微镜下观察肝组织病理学变化。

1.7 肝组织TUNEL染色

取石蜡切片，蛋白激酶K 工作液37 ℃孵育30 min，3%过氧化氢室温孵育10 min，TdT 酶反应液37 ℃避光孵育60 min，HRP 标记的链霉亲和素37 ℃避光孵育30 min，DAB显色，苏木素复染，显微镜下观察阳性细胞数，呈棕黄色显示的即为阳性细胞，计算细胞凋亡率=阳性细胞数/总细胞数×100%。

1.8 蛋白印迹法检测MAPK信号通路相关蛋白表达

取适量肝组织，液氮中研磨，加裂解液裂解，4 ℃12 000 r/min 离心10 min，取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。取50 μg 蛋白电泳分离，将分离后的蛋白湿转到PVDF 膜上，p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK 和ERK 抗体（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，二抗（1∶5 000）室温孵育1 h，ECL法显色，Image J分析条带灰度值，计算目的蛋白相对表达量。

1.9 统计学分析

采用SPSS26.0软件分析数据，所有数据以（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用LSD检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝脏损伤指标检测结果

与正常对照组比较，模型组血浆中ALT、AST和LDH 含量升高（P<0.05）；与模型组比较，熊果酸组血浆中ALT、AST 和LDH 含量降低，而激活剂组血浆中ALT、AST 和LDH 含量升高（P<0.05）；与熊果酸组比较，熊果酸+激活剂组血浆中ALT、AST 和LDH含量升高（P<0.05）；与激活剂组比较，熊果酸+激活剂组血浆中ALT、AST 和LDH 含量降低（P<0.05）。见表1。

表1 各组大鼠血浆中ALT、AST和LDH含量比较Table 1 Comparison of the contents of ALT,AST and LDH in plasma of rats in each group(,n=10)

表1 各组大鼠血浆中ALT、AST和LDH含量比较Table 1 Comparison of the contents of ALT,AST and LDH in plasma of rats in each group(,n=10)

与正常对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与熊果酸组比较：∆P<0.05；与激活剂组比较：▲P<0.05。

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2.2 肝脏氧化应激指标检测结果

与正常对照组比较，模型组肝组织的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；与模型组比较，熊果酸组肝组织的SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低，而激活剂组肝组织的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；与熊果酸组比较，熊果酸+激活剂组肝组织的SOD 和GSH-Px 活性降低，MDA 含量升高（P<0.05）；与激活剂组比较，熊果酸+激活剂组肝组织的SOD 和GSH-Px 活性升高，MDA 含量降低（P<0.05）。见表2。

表2 各组大鼠肝组织中MAD含量和SOD、GSH-Px活性比较Table 2 Comparison of MAD content and SOD and GSH-Px activities in liver tissue of rats in each group(,n=10)

表2 各组大鼠肝组织中MAD含量和SOD、GSH-Px活性比较Table 2 Comparison of MAD content and SOD and GSH-Px activities in liver tissue of rats in each group(,n=10)

与正常对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与熊果酸组比较：∆P<0.05；与激活剂组比较：▲P<0.05。

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2.3 肝组织HE染色结果

正常对照组大鼠肝细胞形态大小正常；模型组和激活剂组大鼠部分区域肝细胞水肿、脂肪变性、片状坏死，且伴有大量中性粒细胞浸润，肝窦结构消失；熊果酸组大鼠肝组织病理损伤减轻，肝细胞轻度水肿，无片状坏死，少量中性粒细胞浸润；熊果酸+激活剂组大鼠肝组织病理损伤程度较激活剂组减轻，但是较熊果酸组加重。见图1。

图1 肝组织HE染色（400×）Figure 1 HE staining of liver tissue

2.4 肝组织TUNEL染色结果

与正常对照组比较，模型组肝细胞凋亡率升高（P<0.05）；与模型组比较，熊果酸组肝细胞凋亡率降低，激活剂组肝细胞凋亡率升高（P<0.05）；与熊果酸组比较，熊果酸+激活剂组肝细胞凋亡率升高（P<0.05）；与激活剂组比较，熊果酸+激活剂组肝细胞凋亡率降低（P<0.05）。见表3、图2。

图2 肝组织TUNEL染色（400×）Figure 2 TUNEL staining of liver tissue（400×）

表3 各组大鼠肝组织细胞凋亡率比较Table 3 Comparison of apoptosis rate of liver tissue cells of rats in each group(,n=10)

表3 各组大鼠肝组织细胞凋亡率比较Table 3 Comparison of apoptosis rate of liver tissue cells of rats in each group(,n=10)

与正常对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与熊果酸组比较：∆P<0.05；与激活剂组比较：▲P<0.05。

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2.5 蛋白印迹法检测结果

与正常对照组比较，模型组肝组织中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表达水平升高（P<0.05）；与模型组比较，熊果酸组肝组织中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表达水平降低，激活剂组肝组织中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表达水平升高（P<0.05）；与熊果酸组比较，熊果酸+激活剂组肝组织中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表达水平升高（P<0.05）；与激活剂组比较，熊果酸+激活剂组肝组织中p-p38 MAPK 和p-ERK 蛋白表达水平降低（P<0.05）。见表4、图3。

图3 肝组织中蛋白表达电泳图Figure 3 Electrophoretic image of protein expression in liver tissue

表4 各组大鼠肝组织中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK和ERK蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-ERK and ERK protein levels in liver tissues of rats in each group(,n=10)

表4 各组大鼠肝组织中p-p38 MAPK、p38 MAPK、p-ERK和ERK蛋白表达水平比较Table 4 Comparison of p-p38 MAPK，p38 MAPK，p-ERK and ERK protein levels in liver tissues of rats in each group(,n=10)

与正常对照组比较：*P<0.05；与模型组比较：#P<0.05；与熊果酸组比较：∆P<0.05；与激活剂组比较：▲P<0.05。

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3 讨论

本研究通过橡皮带环绕结扎大鼠双后肢建立肢体缺血再灌注肝损伤模型，肝组织病理染色结果显示：模型组大鼠部分区域肝细胞水肿、脂肪变性、片状坏死，且伴有大量中性粒细胞浸润，肝窦结构消失，熊果酸组大鼠肝组织病理损伤减轻，肝细胞轻度水肿，轻度片状坏死，少量中性粒细胞浸润；且模型组大鼠肝损伤指标血浆中ALT、AST和LDH 水平均高于正常对照组，熊果酸组大鼠各指标则低于模型组，说明肢体缺血再灌注可引起大鼠肝损伤，而熊果酸对肝脏具有一定保护作用。而Xu 等[12]的研究表明，熊果酸可减轻缺血再灌注引起的心肌损伤，发挥心肌保护作用。为进一步探讨熊果酸发挥肝脏保护作用的具体机制，本研究给予肢体缺血再灌注大鼠MAPK 信号通路激活剂，结果显示：激活剂组大鼠肝脏病理损伤较模型组加重，血浆ALT、AST 和LDH 水平较模型组升高；而与激活剂组比较，熊果酸+激活剂组大鼠肝组织病理损伤减轻，ALT、AST 和LDH 水平降低，说明激活MAPK 信号通路可加重肢体缺血再灌注大鼠肝损伤，而熊果酸可部分抵消激活剂的作用。

氧化应激反应和细胞凋亡是造成组织器官再灌注损伤的主要机制之一。Mei 等[13]研究表明薯蓣皂苷通过SIRT1/Nrf2 信号通路抑制氧化应激，减轻体内外脑缺血再灌注损伤。Yu 等[14]研究发现miR-98-5 p 通过抗氧化应激和抗凋亡减轻脑缺血再灌注损伤。本研究结果显示：模型组大鼠肝细胞凋亡率较正常对照组升高，熊果酸组大鼠肝细胞凋亡率低于模型组；模型组抗氧化指标肝组织SOD 和GSHPx 活性较正常对照组降低，氧化指标肝组织MDA含量较正常对照组升高，而熊果酸组肝组织SOD 和GSH-Px 活性较模型组升高，MDA 含量较模型组降低，说明熊果酸可降低肢体缺血再灌注引起的氧化应激反应，抑制肝细胞凋亡。本研究结果与Di等[15]报道的熊果酸可降低氧化应激反应，改善顺铂造成的听力功能障碍的结果一致。本研究中激活剂组肝细胞凋亡率较模型组升高，肝组织SOD 和GSH-Px活性较模型组降低，肝组织MDA 含量较模型组升高，说明激活MAPK 信号通路促进肝脏氧化应激反应和肝细胞凋亡；与激活剂组比较，熊果酸+激活剂组肝细胞凋亡率降低，肝组织SOD 和GSH-Px 活性升高，肝组织MDA 含量降低，说明熊果酸可拮抗激活剂对肢体缺血再灌注肝损伤大鼠氧化应激和细胞凋亡的促进作用。

氧化应激反应涉及多条信号转导通路，其中MAPK 信号通路在维持机体内氧化-抗氧化动态平衡中发挥重要作用，p38 和ERK 是MAPK 家族中重要的2条通路。肢体缺血再灌注使远端器官受到缺血刺激，打破机体氧化-抗氧化平衡，组织能量代谢紊乱，抗氧化能力减弱，大量自由基产生并堆积，从而激活p38和ERK通路[16-17]。p38通路与炎症、氧化应激等反应过程的调控密切相关，而ERK 通路主要与细胞分裂、生长和增殖有关[18-19]。本研究结果表明：模型组肝组织中p-p38 和p-ERK 蛋白表达升高，熊果酸可降低二者磷酸化水平；激活剂组肝组织中p-p38 和p-ERK 蛋白表达水平较模型组升高，熊果酸+激活剂组二者水平降低，说明熊果酸可部分拮抗激活剂对MAPK 信号通路的激活作用。

综上所述，熊果酸对肢体缺血再灌注引起的肝损伤具有保护作用，其可能是通过抑制MAPK 信号通路降低氧化应激反应和细胞凋亡发挥作用。本研究的不足之处是缺乏细胞实验的佐证，此外对熊果酸发挥肝损伤保护作用的具体机制研究不够深入，因此仍需要进一步完善。