膀胱癌组织中ILK、P16表达与临床病理特征和Cyclin D1的关系

焦凌玉,黄立娜,李晓丽

商丘市第一人民医院病理科(河南 商丘 476000)

膀胱癌是一种恶性肿瘤,病死率高。相关研究证实[1]肿瘤的发生发展以及转移等过程较为复杂,细胞周期失控在起重要作用,此外,肿瘤细胞间黏附力下降与之联系密切。故而,探寻膀胱癌发生发展的关键靶基因或者因子,作为重要标志物,用于其临床诊断、预后判定,对患者的生存率提高、预后改善至关重要。整合素连接激酶(intergrin-linked kinase,ILK)作为59 kDa细胞中一个信号蛋白,其主要作用为催化蛋白质激酶B以及糖原合成酶激酶-3,相关研究表明[2]ILK与结肠癌、前列腺癌、乳腺癌相关紧密。P16是一种具有多种肿瘤抑制作用的肿瘤抑制基因,其中P16的缺失与变异的比例高达75%[3]。细胞周期蛋白D1(Cyclin D1)是一种特殊的细胞周期调控因子,其在多种癌症中呈现高表达。现阶段有关ILK、P16、Cyclin D1与膀胱癌之间关系的研究尚不多见[4]。本研究采用细胞免疫组化SP法检测ILK、P16、Cyclin D1在膀胱癌及正常组织中的水平差异,为下一步深入了解肿瘤发生机制、诊断和评价预后提高参考依据。

1 资料与方法

1.1一般资料选取2020年5月-2022年5月行手术切除的80例膀胱癌组织标本作为膀胱癌组,纳入标准:术后均经病理证实为原发性膀胱癌;所有研究对象均已签署知情同意书。排除标准:有放化疗史;合并其他恶性肿瘤;膀胱炎等其他可影响实验结果的疾病。膀胱癌组男56例,女24例;年龄44～72岁,平均(56.74±6.21)岁;分化程度:高分化34例,中分化26例,低分化20例。另收集80例正常膀胱组织标本作为正常组织组。正常组男58例,女22例;年龄41～74岁,平均(56.69±6.25)岁。两组在性别、年龄比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。

1.2方法①试剂:福州迈新科技发展有限公司供应的鼠抗人P16单抗;博奥森公司购买家兔抗人ILK多克隆抗体、免疫组化和DAB染色试剂盒;福州迈新科技发展有限公司的兔抗人Cyclin D1。②免疫组化:采用10%甲醇溶液将标本进行固定,以2cm×2cm×2cm的体积块状组织进行研究,采用传统的石蜡包埋;采用乳酸对载玻片进行处理,然后将组织切片为薄片(4μm),粘贴在经过处理的载玻片上,50℃烤箱中烘烤6～10h。对烘烤后的组织予以脱蜡处理,使用医用微波炉抗原修补3min;以0.2%的胰蛋白酶和3%的双氧水封闭发酵10min。用PBS溶液5min一次清洗3次;在山羊正常血清滴加之后将其置入37℃水浴箱10min。将残余的液体甩干后,分别加入ILK、P16和Cyclin D1的抗体,再以PBS缓冲剂和正常山羊血清作为对照,在4℃条件下保存12h。注入振动装置(PBS缓冲剂)3次,每次5min;将链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶溶液注入10min后,放置振动装置(PBS缓冲剂)3次,每次5min。二氨基联苯胺显色5min,采用苏木素行衬染,时间为3min,用盐酸酒精进行分化,用氨水进行反蓝;从低度到高度的酒精脱水,于二甲苯脱干后,用传统的中性树脂进行封片。结果评判:阳性:呈棕黄色或棕褐色的颗粒,底色为蓝色;添加PBS缓冲剂和正常山羊血清为阴性。在(×200)高倍显微镜下,选择10个视野,其中,阳性细胞的表达量≥10%,即为阳性,在10%以下,即为阴性。

1.3观察指标①比较膀胱癌组织及正常膀胱组织ILK、P16、Cyclin D1的阳性表达率;②分析膀胱癌组织中ILK、P16、Cyclin D1表达与患者临床病理特征的关系。

1.4统计学处理运用SPSS 22.0统计学软件,计数资料用n(%)表示,组间比较采用χ2检验。相关性分析采用Spearman等级相关分析法,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1ILK、P16、CyclinD1在膀胱癌组织及正常膀胱组织中的表达膀胱癌组织ILK、Cyclin D1阳性表达率显著高于正常膀胱组织,正常膀胱组织P16阳性表达率显著高于膀胱癌组织(P<0.05),见表1。

表1 ILK、P16、Cyclin D1在膀胱癌组织及正常膀胱组织中的表达[n=80,n(%)]

2.2ILK、P16、CyclinD1与不同病理分级的关系高分化组织ILK、Cyclin D1阳性表达率显著低于中低分化组织,高分化组织P16阳性表达率显著高于中低分化组织(P<0.05),见表2。

表2 ILK、P16、Cyclin D1与不同病理分级的关系[n(%)]

2.3P16与ILK、CyclinD1在膀胱癌中表达的关系经Spearman相关分析显示,膀胱癌中ILK与P16表达呈负相关(r=-0.274,P<0.05),Cyclin D1与P16表达亦呈负相关(r=-0.375,P<0.05),见表3。

表3 P16与ILK、Cyclin D1在膀胱癌中表达的关系(n=80)

3 讨论

膀胱癌是最普遍的泌尿系统恶性肿瘤之一,移行细胞癌约占95%[5-6]。近些年,通过分子生物学的深入探讨,发现癌症的形成是一种多基因、多时期的分子过程,在此过程中,癌细胞被活化、抑制癌症的基因失活及其相互作用,其表达的蛋白在调节细胞的循环中起着重要作用[7]。

Cyclin D1是一种调控细胞周期的因子,在多种原发肿瘤中呈高水平表达,在预测癌症方面起着非常关键的作用[8]。ILK作为59 kDa细胞中一个信号蛋白,其主要的作用机制为催化蛋白质激酶B以及糖原合成酶激酶-3,而高娟等[2]研究表明ILK与结肠癌、前列腺癌、乳腺癌相关;严敏琴等[9]研究显示,利用siRNA ILK或小分子抑制剂对ILK活性进行抑制,能有效地降低肿瘤细胞的发生发展。本结果显示,Cyclin D1和ILK在膀胱癌中的表达水平显著高于正常组织,随着肿瘤的恶性程度越高,Cyclin D1和ILK的表达也随之升高。说明Cyclin D1的异常表达是其发生的重要因素。ILK和Cyclin D1可能与膀胱癌的发生、发展具有一定的时空协同效应,提高了肿瘤的侵入性,提示两者的结合对膀胱癌的诊断和预后判断有积极作用。

P16基因和已知的p53和Rb基因同是抗肿瘤基因,属于多肿瘤抑制基因。李苒等[10]研究发现,P16的突变和突变率高达75%,远高于P53的50%。故而认为P16是肿瘤发生发展中的一个关键环节。本研究结果发现:P16在膀胱癌中的表达水平显著较正常组织低,随着肿瘤的恶性程度越高,P16的表达也随之降低;此外,还发现ILK、Cyclin D1表达和P16表达呈显著负相关。故认为,P16低水平导致ILK和Cyclin D1的水平升高,协同参与了膀胱癌的发生和发展。因此,结合三项指标对评价肿瘤的分级和预后具有一定的参考价值。

综上所述,ILK、Cyclin D1在膀胱癌中均呈过高表达,P16在膀胱癌中均呈过低表达,同时和病理分化程度紧密相关,提示其参与膀胱癌的发生发展,可作为评估肿瘤病理学分期的相关依据,其综合应用对膀胱癌的诊断和预后具有一定的指导意义。