黄甲软肝颗粒解酒护肝药效学研究

张 云,茅向军,张丽艳,于 婷,唐海姣,刘 洋,王宗权*,华 杰*

1.贵州中医药大学(贵州 贵阳 550025) 2.盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司(广东 珠海 519031) 3.浙江维康药业股份有限公司(浙江 丽水 323000)

急性肝损伤(acute liver injury)是常见的肝脏疾病,由多种致病因素引起,包括病毒感染,酒精摄入等导致氧化应激、炎症反应和肝细胞凋亡等病理改变,长期的肝损伤会导致肝组织纤维化,还可能进一步引起肝硬化和肝癌的发生。因此预防和治疗急性肝损伤具有重要的临床意义[1]。

黄甲软肝颗粒(huangjia ruangan granules)由黄芪、鳖甲、葛根、柴胡、灵芝、赤芍、丹参、三七、鸡骨草和叶下珠10味药组成。具有理气疏肝、活血软坚的功效,用于治疗肝功能损伤及早期肝硬化[2]。有研究显示[3]黄芪能显著降低实验性肝纤维化大鼠肝脏功能的结构损伤,对实验性大鼠肝损伤具有保护作用。黄芪粗提物、黄芪总皂苷对CCl4引起的急性肝损伤小鼠具有显著的保护作用[4]。鳖甲有效肽段能够通过抑制促炎因子和EGFR,调节TIMPs/MMPs的平衡,进一步调控MAPK信号与TGF-β1/Smad信号发挥抗肝纤维化的疗效[5]。同时葛根素也具有一定的治疗急性肝损伤和抗肝纤维化作用,葛根素能够缓解炎症因子对肝组织造成的损伤,从而达到抗肝纤维化的作用[6-7]。小叶柴胡总黄酮对CCl4所致的小鼠急性肝损伤和北柴胡乙醇提取物对D-氨基半乳糖胺所致小鼠急性肝损伤具有显著的保护作用[8-9]。丹参、三七、赤芍、鸡骨草均对多因素引起的急性肝损伤小鼠具有很好的保护作用[10-14]。因此本研究通过建立小鼠急性肝损伤模型来观察黄甲软肝颗粒对肝的保护和预防作用,为后续临床试验提供理论依据。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1 实验动物 SPF级昆明小鼠,体质量(18～22g),生产许可证号:SCXK(粤)2022-0002,使用许可证号:SYXK(粤)2020-0102,购自广东省医学实验动物中心。

1.1.2 药物与试剂 黄甲软肝颗粒[盈科瑞(横琴)药物研究院有限公司,批号:TC22001-1];总谷胱甘肽检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);丙二醛(MDA)检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);乙醇脱氢酶(ADH)活性检测试剂盒(北京索莱宝科技有限公司);HE染液(Servicebio公司)。

1.1.3 主要仪器 7890B气相色谱仪美国安捷伦公司;Epoch2微孔板分光光度计,美国Biotek公司;Eclipse Ti-S显微镜,日本Nikon公司。

1.2实验方法

1.2.1 黄甲软肝颗粒对小鼠醉酒的解酒作用 昆明小鼠60只,雄性,按体质量随机分为6组,每组10只,分别为:正常组,模型组,黄甲软肝颗粒低剂量组(2g/kg),黄甲软肝颗粒中剂量组(4g/kg),黄甲软肝颗粒中剂量组(8g/kg),谷胱甘肽组(246mg/kg)。按设计剂量灌胃给药,正常组和模型组给予20mL/kg蒸馏水,1次/d,连续7d。末次给药前各组小鼠禁食12h,末次给药60min后,除正常组外的各组按14mL/kg灌胃给予60°红星二锅头白酒,1h后摘眼球取血。血液中乙醇浓度检测:摘眼球取血约0.8mL,EDTA或肝素抗凝全血-20℃保存1周内进行检测。其中取0.1mL血样于顶空进样瓶中,加入100μL正丁醇(浓度为4μg/mL)作内标,加盖密封后采用顶空瓶气相色谱法(GC)测定血液中乙醇浓度。肝脏组织的谷胱甘肽、MDA含量及ADH活力检测:动物取血后脱颈椎处死,取肝脏100mg于-80℃保存,制成肝匀浆后,测定谷胱甘肽、MDA、ADH活力。

1.2.2 黄甲软肝颗粒对CCl4诱导的急性肝损伤的保护作用 昆明小鼠60只,雄性,分别按体质量随机分为6组,每组10只,分别为:正常组,模型组,黄甲软肝颗粒低剂量组(2g/kg),黄甲软肝颗粒中剂量组(4g/kg),黄甲软肝颗粒高剂量组(8g/kg),谷胱甘肽组(246mg/kg)。连续给药14d,动物末次给药后禁食16h,模型组及各给药组灌胃0.5% CCl4植物油溶液5mL/kg,正常组灌胃植物油5mL/kg,24h后,摘眼球取血及分离保存肝脏组织用于指标检测和组织病理学检查。

1.3观察指标血清指标检测:小鼠取血分离血清,用全自动血生化仪测定血清中的谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)。肝脏组织抗氧化指标检测:取肝脏左叶同一部位,生理盐水洗净、滤纸吸干后称重,置于EP管中剪碎,按试剂盒说明书制备肝组织匀浆并测定丙二醛(MDA)和总谷胱甘肽。肝组织病理学检查:取小鼠肝右叶用4%多聚甲醛固定24h,从中部做横切面取材,乙醇脱水,石蜡包埋常规病理制片石蜡包埋,5μm切片,苏木精伊红染色,显微镜下观察组织学变化。切片观察肝细胞坏死、脂肪变性和胞浆疏松、水肿的程度。

1.4统计学处理实验数据由GraphPad Prism 9生物统计学软件进行统计学处理:计量资料以Mean±SD表示,采用方差分析结合Dunnett’s多重比较法进行分析,肝脏病理学评分采用Kruskal-Wallis秩和检验结合Dunnett’s多重比较法进行分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1黄甲软肝颗粒对醉酒小鼠的解酒作用

2.1.1 对急性酒精性肝损伤小鼠血液中乙醇浓度的影响 与正常组比较。模型组血液中酒精含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较,黄甲软肝颗粒高剂量组和谷胱甘肽组小鼠血液中乙醇浓度显著降低(P<0.05),见图1。

与模型组比较,*:P<0.05;与正常组比较,**:P<0.01。

2.1.2 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织的谷胱甘肽含量的影响 与正常组比较,模型组肝脏组织的谷胱甘肽含量显著降低(P<0.01),与模型组比较,黄甲软肝颗粒高剂量组的谷胱甘肽含量有增加的趋势(P>0.05),谷胱甘肽组的谷胱甘肽含量显著增加(P<0.05),见图2。

与模型组比较,*:P<0.05;与正常组比较,**:P<0.01。

2.1.3 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织MDA含量的影响 与正常组比较,模型组肝脏组织MDA含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较,黄甲软肝颗粒中剂量组和谷胱甘肽组肝脏组织MDA含量显著降低(P<0.05),见图3。

与模型组比较,*:P<0.05;与正常组比较,**:P<0.01。

2.1.4 对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织ADH活性的影响 与正常组比较,模型组肝脏组织ADH活性显著降低(P<0.01),与模型组比较,黄甲软肝颗粒高剂量组ADH活性显著增加(P<0.05),谷胱甘肽组ADH活性显著增加(P<0.05),见表1。

表1 黄甲软肝颗粒对小鼠肝脏组织ADH活力的影响

2.2黄甲软肝颗粒对小鼠急性肝损伤模型的作用

2.2.1 对CCl4急性肝损伤血清肝功能指标影响 与正常组比较,模型组小鼠血清ALT、AST活性显著增加(P<0.01)。与模型组比较,黄甲软肝颗粒中剂量组小鼠血清ALT活性显著降低(P<0.05);AST活性显著降低(P<0.05);谷胱甘肽组血清ALT、AST活性均显著降低(P<0.05或P<0.01),见表2。

表2 对急性肝损伤小鼠肝功能指标的影响

2.2.2 对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏组织中MDA含量的影响 与正常组比较,模型组肝脏组织MDA含量显著增加(P<0.01)。与模型组比较,黄甲软肝颗粒中剂量组和谷胱甘肽组肝脏组织MDA含量显著降低(P<0.05),见图4。

与模型组比较,*:P<0.05;与正常组比较,**:P<0.01。

2.2.3 对CCl4急性肝损伤小鼠肝脏组织中谷胱甘肽含量的影响 与正常组比较,模型组肝脏组织的谷胱甘肽含量显著降低(P<0.01),谷胱甘肽组的谷胱甘肽含量显著增加(P<0.05),见图5。

与模型组比较,*:P<0.05;与正常组比较,**:P<0.01。

2.2.4 对CCl4急性肝损伤肝脏病理组织学的影响 肝组织HE染色光镜下观察如图6所示:正常组肝细胞排列整齐、结构清晰、脂肪含量较少;模型组肝细胞排列紊乱结构疏松,细胞体积明显增大,部分细胞的胞浆、胞核消失。与模型组比较,黄甲软肝颗粒中、高剂量组和谷胱甘肽组小鼠肝细胞结构有一定改善,细胞浆和细胞核溶解程度有所减轻。

A.正常组,B.模型组,C.黄甲软肝颗粒低剂量组,D.黄甲软肝颗粒中剂量组,E.黄甲软肝颗粒高剂量组,F.谷胱甘肽组。

3 讨论

本实验采用60°白酒进行造模,以谷胱甘肽作为阳性对照药物,研究黄甲软肝颗粒对小鼠醉酒的解酒作用。黄甲软肝颗粒和谷胱甘肽片对小鼠血液中乙醇浓度显著降低(P<0.01)。说明黄甲软肝颗粒对小鼠肝组织的酒精起到一定的分解转化作用,有效降低组织中乙醇等相关物质的含量,并且与谷胱甘肽有相同的治疗效果;黄甲软肝颗粒的谷胱甘肽含量有增加的趋势,说明黄甲软肝颗粒可有效增加小鼠肝组织谷胱甘肽的含量,通过促进肝脏的修复功能,并且对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织中谷胱甘肽的含量有增加的趋势,通过与肝组织中的氧化物质反应,以达到减轻酒精性肝损伤的目的。

实验中黄甲软肝颗粒通过加速MDA的分解转化,使小鼠肝组织含量始终保持一个较低的水平,能有效降低肝损伤的风险。说明在该实验条件下,黄甲软肝颗粒对CCl4急性肝损伤小鼠肝组织中MDA的含量有明显的降低趋势,对降低小鼠肝组织MDA含量与谷胱甘肽片有相同的治疗效果;与正常组比较,模型组肝脏组织ADH活性显著降低(P<0.01),与模型组比较,黄甲软肝颗粒ADH活性显著增加(P<0.01),通过激活肝组织中ADH的活性,ADH催化乙醇脱氢反应生成乙醛,乙醛在体内经ALDH继续催化氧化反应,生成乙酸,继而合成乙酰辅酶A进入三羧酸循环,最终分解成CO2和H2O排出体外。

本实验通过黄甲软肝颗粒对CCl4诱发的小鼠急性肝损伤模型的治疗作用,研究黄甲软肝颗粒对肝组织细胞的改善作用。正常人血清中ALT和AST正常值<40U/L,当肝细胞受到损伤时,细胞膜电位受到破坏,ALT和AST进入血液,导致其在血清中水平升高,其水平越高肝损伤越严重。与模型组比较,黄甲软肝颗粒对小鼠血清ALT活性有显著降低的趋势;AST活性显著降低(P<0.05);且与谷胱甘肽对小鼠血清ALT、AST活性降低有相类似的功效。

通过HE染色液对正常组、模型组、给药组和谷胱甘肽组肝细胞病理切片在光学显微镜下观察,结果显示正常组肝细胞排列整齐、结构清晰、脂肪含量较少;模型组肝细胞排列紊乱结构疏松,细胞体积明显增大,部分细胞的胞浆、胞核消失。与模型组比较,黄甲软肝颗粒中、高剂量组和谷胱甘肽组小鼠肝细胞结构有一定改善,细胞浆和细胞核溶解程度有所减轻。

综上所述,黄甲软肝颗粒对小鼠醉酒有较好的解酒作用;能降低急性酒精性肝损伤小鼠血液中乙醇浓度水平,减轻肝组织氧化损伤;能降低CCl4急性肝损伤小鼠的肝功能损伤和氧化损伤,改善肝组织细胞病变,表明黄甲软肝颗粒具有较好的解酒护肝作用。