藤黄健骨丸调控BMP-2/Smad 信号通路治疗绝经后骨质疏松症

2023-12-23张文静王雨辰顾晶业律广富皮子凤

吉林中医药 2023年12期

张文静，王雨辰，段瑶，顾晶业，律广富，皮子凤，林喆

（长春中医药大学，长春 130117）

骨质疏松症（osteoporosis，OP）属于一种全身性骨代谢疾病，发病过程中，骨稳态平衡遭到破坏，引致骨骼承重能力减弱，加大脆性骨折的风险[1]。绝经后骨质疏松症（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是一种重要的亚型，尤其发生于绝经后妇女。其主要病因是由于卵巢功能下降和雌激素分泌减少而导致的骨组织结构改变，增加了骨折的风险[2-3]。由于发病隐秘，未能得到充分的重视，严重降低了绝经后女性的身体水平。据预测，由于骨质疏松症引发的骨折问题，医疗费用在2050 年可能将高达1 630 亿元[4]。

藤黄健骨丸[5]来源于国医大师刘柏龄多年临床经验所制成的中药复方制剂。全方配伍由7 味中药材组成，熟地黄为君药，臣药用肉苁蓉、淫羊藿、骨碎补、鹿衔草，具有补肾阳、增强精血、滋养肾脏、祛除风湿、增强筋骨等功能。加以鸡血藤，能补血、活血，调通人体经络，增强筋骨。莱菔子，可以帮助调理气血，使得所有的药材能更好的发挥效用，这款中药复方被广泛用于治疗各种骨科疾病。

骨形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）是骨组织中重要的生长因子。研究发现，BMP-2 在骨形成中发挥着重要作用[6-7]。骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein-2）BMP-2/Smad 通路是能够维持骨稳态的重要信号通路，当Smad 信号被激活时，骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化，减少破骨细胞活性，从而减少骨质疏松症的发生[8-10]。但藤黄健骨丸通过BMP-2/Smad 信号通路治疗骨质疏松症缺乏深入研究。

因此，本实验研究采用摘除大鼠双侧卵巢模型模拟临床绝经后骨质疏松症，考察藤黄健骨丸对绝经后骨质疏松的影响，并基于BMP-2/Smad 信号通路探究其分子机制，为该药的深入研究提供新依据，为临床应用提供新思路。

1 实验材料

1.1 药品与试剂藤黄健骨丸（批号：2022100522039，长春人民药业集团有限公司）；仙灵骨葆胶囊[批号：国药准字Z20025337，国药集团同济堂（贵州）制药有限公司]；戊巴比妥钠（批号：86-01-22，上海化学试剂采购供应站分装厂）；青霉素（批号：210202，兽药字，华北制药集团动物保健品有限责任公司）；无水乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、二甲苯（国药集团化学试剂有限公司）、Von-Kossa 染液套装（B1013，百仟度）、盐酸（国药集团化学试剂有限公司）、氨水（国药集团化学试剂有限公司）、中性树胶（10004160，武汉百仟度生物科技有限公司）、分化液（B1005-3，百仟度）、返蓝液（B1005-4，百仟度）。RIPA 裂解缓冲液（P0013B，碧云天生物技术有限公司）；Smad1 抗体，BMP-2 抗体、Runx2 抗体、抗鼠抗体、抗兔抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）。

1.2 实验动物 1.5 月龄雌性SD 大鼠72 只，体质量（200±10）g。所有大鼠均购于辽宁长生生物技术股份有限公司，许可证号：SCXK（辽）2020-0001。动物饲养于长春中医药大学实验动物中心SPF 屏障级动物室内。

1.3 实验仪器小动物骨骼强度测定仪（济南益延科技发展有限公司），脱水机（JJ-12J，武汉俊杰电子有限公司），包埋机（JB-P5，武汉俊杰电子有限公司），病理切片机（RM2016，上海徕卡仪器有限公司），正置光学显微镜（NIKON ECLIPSE C，尼康，日本），成像系统（NIKON DS-U3，尼康，日本），多功能化学发光成像系统（uvitec，17200497，法国）。

2 实验方法

2.1 实验造模方法除了假手术组，其余各组大鼠以0.5% 戊巴比妥钠（40 mg/kg）腹腔注射麻醉，大鼠被安置在手术台上，使其四肢固定，接着进行皮肤的预处理，对手术区的皮肤进行消毒。在大鼠背部中线位置，作一1.5 ～2 cm 的纵形切口，可见到奶白色的组织以及粉红色的“菜花状”卵巢，随后采用分离钳进行夹紧，进行卵巢的结扎以及切除，然后逐层对皮肤进行缝合并消毒。假手术组大鼠切除等同于卵巢重量的周围脂肪。大鼠术后给予口服青霉素混悬液，术后注意保温[11-12]。

2.2 动物分组及给药将大鼠随机分为6 组，每组12只。分别为假手术组（SHAM）、模型组（OVX）、仙灵骨葆胶囊组（XLGB）、藤黄健骨丸低剂量组（THJGW-L）、藤黄健骨丸中剂量组（THJGW-M）及藤黄健骨丸高剂量组（THJGW-H）。

从造模手术后第3 天开始，按照人与大鼠表面积换算药物等效剂量，藤黄健骨丸粉末进行用水溶解制成混悬液灌胃，低、中、高剂量组给药剂量分别为0.15 g/kg/d、0.3 g /kg/d、0.6 g /kg/d；假手术组和模型组大鼠以等体积生理盐水灌胃；仙灵骨葆胶囊和藤黄健骨丸均为复方中药，因其在临床上已经被广泛用于治疗骨质疏松症，且治疗有效、安全[13-15]。阳性组采用其水溶液灌胃给药，给药剂量为0.10 g/kg/d。每日灌胃1 次，连续8 周。每周称量记录1 次大鼠体质量。

2.3 取材 8 周后，麻醉安乐死处理，在无菌的环境中提取大鼠的子宫和肾脏，并量取其重量。切割大鼠双侧的股骨并剥离肌肉，之后测量大鼠右侧股骨的骨骼强度。对大鼠左侧股骨，用4%多聚甲醛固定24 h以上，常规石蜡包埋切片，进行病理染色分析。

2.4 蛋白免疫印迹法（Western blot）取大约80 mg的大鼠骨髓组织，经液氮冷冻后进行研磨处理。按照骨组织蛋白提取试剂盒的使用指南，提取蛋白，并运用BCA 方法测量蛋白质的含量。蛋白上样量为20 μg，进行10% SDS-PAGE 电泳分离，并转移到PVDF 膜上。转膜1 h 后，用奶粉封闭2 h。封闭结束后使用TBST缓冲液进行3 次洗膜。加入GAPDH（1:5 000），BMP-2（1:2 000），Smad1（1:2 000），Runx2（1:1 000）一抗，4℃孵育过夜，加入二抗（1:3 000）室温孵育3 h，再用TBST 缓冲液清洗3 次。显色，以GAPDH 作为内参，使用Image-J 软件对所有电泳条带的灰度值进行分析。

2.5 统计学分析采用SPSS 22.0 软件对实验数据进行评估，并将所有的结果用均数±标准差（±s）表示。利用单因素方差分析组内数据差异。确定统计显著性的标准设为P＜0.05。

3 实验结果

3.1 绝经后骨质疏松大鼠模型体质量变化大鼠术后的体质量变化，如图1。对大鼠进行去卵巢手术后，大鼠体质量明显降低，藤黄健骨丸给药后，体质量恢复至正常。

图1 各组大鼠8 周体质量变化

3.2 绝经后骨质疏松大鼠子宫及肾脏指标测定大鼠的子宫和左右肾重量，结果见表1。在对比假手术组的情况下，模型组的大鼠子宫和肾脏重量显然减少（P＜0.05），具有显著性差异；相较于模型组，藤黄健骨丸高剂量组和仙灵骨葆胶囊组都能有效的增强大鼠的肾脏重量，同时对子宫重量也展现出提升的趋势，然而它们和模型组之间的差别并不显著（P＞0.05）。

表1 藤黄健骨丸对模型大鼠子宫和肾脏重量的影响（± s，n = 12） g

注：与假手术组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别子宫右肾SHAM 1.15±0.06△ 1.00±0.08△OVX 0.74±0.06## 0.89±0.07##THJGW-L 0.76±0.04 0.96±0.11 THJGW-M 0.87±0.03△ 0.96±0.09 THJGW-H 0.92±0.05△ 0.97±0.12##XLGB 1.04±0.03△ 0.97±0.10##

3.3 绝经后骨质疏松大鼠骨强度值将大鼠右侧股骨放入小动物骨骼强度测定仪，依据骨头被压断的最高负荷压力来测试骨骼的强度，具体的测量结果如图2所示。

图2 各组大鼠右侧股骨骨强度值

3.4 VonKossa 染色 VonKossa 钙盐染色染色结果可以看出（如图3），假手术组可见钙离子大量沉积，骨组织结构完整，骨小梁排列规律，结构紧密；模型组，可见大量脂肪细胞，钙离子沉淀减少，骨髓细胞数量大量减少；藤黄健骨丸治疗后骨结构有所改善，骨细胞增多，钙离子沉积增多，骨细胞增多，脂肪细胞减少。

图3 各组大鼠左侧股骨组织形态结构（VonKossa 染色，×200，黑色箭头-钙离子沉积；红色箭头-脂肪细胞；黄色箭头-骨细胞）

3.5 Western Blot 实验结果与假手术组比较，模型组Runx2、BMP-2 及Smad1 蛋白表达显著降（△P＜0.05，△△P＜0.01），表明去卵巢手术可以显著降低骨组织中Runx2、BMP-2 及Smad1 的蛋白含量；与模型组比较，藤黄健骨丸高剂量组和仙灵骨葆胶囊组均明显上调Runx2、BMP-2 及Smad1 蛋白的表达（#P＜0.01，##P＜0.01），藤黄健骨丸可以改善骨丢失，促进成骨形成。见表2，如图4。4 讨论

表2 藤黄健骨丸对模型大鼠骨组织Runx2、Smad1、BMP-2蛋白表达的影响（± s，n = 3）

注：与假手术组比较，# P ＜0.05，## P ＜0.01；与模型组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 Runx2/GAPDH Smad1/GAPDH BMP-2/GAPDH SHAM 0.64±0.11 0.58±0.05 0.76±0.10 OVX 0.31±0.12## 0.32±0.04## 0.32±0.11#THJGW-L 0.36±0.05 0.32±0.10## 0.54±0.03△△THJGW-M 0.56±0.09△△ 0.42±0.01 0.63±0.03 THJGW-H 0.67±0.08△ 0.50±0.06△ 0.72±0.06△XLGB 0.68±0.06△ 0.54±0.03△ 0.78±0.11△

图4 各组大鼠骨组织中Runx2、Smad1、BMP-2 蛋白表达电泳

中医学将骨质疏松症归于“骨痿”“骨极”“骨枯”等范畴[16]。《素问·痿论篇》解读“由肾系主导的骨质和髓液，如果肾气过度增热，会引发腰背部无法保持挺直，使骨质干燥，髓液减少，这便构成了骨痿的病象”。与此同时，《金匮要略·中风历节病》中的描述是：“过量摄入咸味食物会对骨质构成破坏，骨质的损害之后会产生肌无力，这个病状被称作枯病。”《素问·五藏生成》论述：“肾具有调节骨髓生成的能力，肾中的精力充沛时，骨髓就能正常生化，骨骼也会变得强壮。但是，若肾气消耗过大，骨髓就会失去补充。”因此，绝经后骨质疏松与骨痿等骨疾病的病因和病理有许多相似之处。中医认为，该病病变在骨，其本在肾。肾是维护骨髓生长和骨质健康的关键器官，只有髓液充盈，骨骼才能保持健康。同样的，肾也是身体的精力储备，只有充足的精力，才能使髓液滋润骨骼，帮助骨骼得到营养。

目前临床上治疗绝经后骨质疏松症的药物[17-19]主要有几大类，分别是雌激素和选择性雌激素受体调整剂、雷洛昔芬、双膦酸盐以及地诺单抗等。雌激素主要包括雌二醇和雌酮，在女性进入更年期以后，雌激素的产生能力会开始下降，这时候患者的骨密度也会明显降低。根据临床实验结果，雌激素治疗显著减少骨折的发生率[20]，因此它展现了治疗骨质疏松的效果。经过随机实验，已经验证口服或者静脉注射双膦酸盐可以降低骨折的概率[21-23]。但是会出现恶心、呕吐，甚至肾功能损害等不良反应[24]。地诺单抗是第一种获得许可，专门用于治疗骨质疏松症的生物药。它和双膦酸盐不同，其对肾机功能降低的女性更为合适。另一方面，特立帕肽是通过人工合成的重组人甲状旁腺激素氨基酸末端1-34 活性片段，其主力作用是促进骨质生成，然而可能导致出现肌骨系统损伤、代谢和营养问题以及皮肤和皮肤附件损坏等副作用[25]。活性维他命D 目前在临床上是治疗骨质疏松症的基础药物。它不仅能减少更年期和老年骨质疏松症的骨折风险，也对类固醇性骨质疏松病有疗效[26]。

西医治疗骨质疏松症多数会引发其他疾病，中药资源丰富，药效安全。在治疗骨质疏松的过程中，中医学常针对其病源和病理进行调整和改善，主要是通过益肝和补肾，以及配合活血药用于治疗由血液瘀积引发的疼痛。藤黄健骨丸是一种中成药，其主要成分包括熟地黄、鹿衔草、骨碎补（烫）、肉苁蓉、淫羊藿、鸡血藤等。肉苁蓉可以温补肾阳，通经络，强筋骨；而熟地黄有助于益精填髓，活化血液，消除瘀血；莱菔子可以调节气血和健骨，同时也防止滋腻过度；鸡血藤有如活血行气、滋阴养肾的效果；淫羊藿能去除风湿，补肝和肾；骨碎补有益于肾阳，健骨，缓解疼痛。复方涵盖7 种药材，其中6 种都是归类于肾经。根据中医学的观念，“肾主骨生髓”，这些药材可以共同发挥效力，从根本上帮助治疗骨质疏松等骨科疾病。除了能够以肾虚血瘀为原理来缓解四肢疼痛和抑制骨头的吸收，还可以增进成骨细胞的生长，促进骨头的重塑，减少破骨细胞的活性，提高血中钙的含量。此外，它还可以降低血液的黏稠度，阻止血小板的集结，提升骨质密度[27]。

据研究显示，张林等[28]所研究的对于藤黄健骨胶囊治疗骨质疏松症（肾虚血瘀型）的疗效评价，指出此药物能有效缓解病患的病症，推动骨密度和骨质的新陈代谢，因此，病患的生活品质大幅提升，具有较高的临床应用价值。另外，单梅花等[29]亦在以藤黄健骨胶囊对64 位高龄、患有肾虚血瘀型骨质疏松症的病患进行实验时，发现该药品的显著治疗效果，能大幅减缓病患的病症。

本实验采用的去除卵巢方法来建立的骨质疏松模型是目前最广泛被用来模拟女性绝经后骨质疏松的动物模型[30]。通过这个模型，进行大鼠双侧卵巢切除手术，使其体内雌激素含量降低，骨质代谢速度加快，骨密度大幅度减少，有效地呈现出女性绝经后由于雌激素水平下滑，骨密度降低，骨骼生长与吸收不平衡所产生的骨质疏松病症[31]。本研究结果表明，去卵巢手术可显著降低大鼠体质量、子宫重量及肾脏质量。藤黄健骨丸干预后，能明显增加大鼠的子宫和肾脏重量。提示藤黄健骨丸从肾源出发，强肾生髓，改善骨质疏松症。骨强度表明藤黄健骨丸能够显著提升去卵巢大鼠的股骨强度，提高荷载能力，对骨质疏松有较好的治疗作用。VonKossa 染色提示藤黄健骨丸可以明显改善去卵巢大鼠的病理形态，增加骨中钙离子的沉积，减少脂肪细胞的生成，改善骨小梁结构。

BMP-2/Smad 信号通路影响成骨分化，对骨稳态的平衡起到关键作用的信号通路[32]。BMP-2 可以与细胞膜受体结合，上调转录因子Runx2 的蛋白表达，促进成骨的分化[33]。Runx2能够影响骨髓细胞的分化过程，对骨的生成扮演重大角色。本次研究表明，相较于假手术组，模型组大鼠的Runx2 、BMP-2 和Smad1 等蛋白水平降低；当藤黄健骨丸以不同剂量治疗后，与模型组对比，这些对骨生成有影响的蛋白水平在不同程度上升高，这揭示了藤黄健骨丸可通过调控和骨生成相关的蛋白来影响绝经后骨质疏松症，其作用机制可能通过BMP-2/Smad 信号通路来促进骨生成。