慢痞消组方中药对嗜黏蛋白阿克曼菌、大肠杆菌和粪肠球菌的增殖影响及药效规律初探

王 钰，褚福浩，程思怡，柯凯乐，郑 直，丁 霞

（北京中医药大学，北京 102488）

我国慢性胃炎、胃癌均呈高发态势[1]。CORREA P[2]提出的肠型胃癌的级联反应模式中胃癌前病变是降低胃癌发生率的关键阶段[3]。国医大师路志正提出调气养阴、活血解毒的核心治法，根据其临床经验研发的慢痞消有效阻断慢性胃炎炎癌转化，缓解患者临床症状[4-5]。前期研究证实慢痞消能有效改善大鼠胃黏膜病理损伤，改善胃黏膜炎症状态，恢复胃酸分泌功能，降低其血清中炎症因子水平[6]。

胃癌及胃癌前疾病与肠道菌群关系密切，致病菌和益生菌失调能影响宿主远端器官机能。胃癌患者粪便菌群和肠黏膜菌群的组成与健康个体存在显著差异，益生菌比例降低[7]。前期研究发现慢性胃炎炎癌转化不同阶段模型大鼠的肠道菌群的丰度、多样性和组成存在显著差异[8]。其中特征性菌群中的粪肠球菌（enterococcus faecalis，E.fa）可诱导胃上皮细胞产生活性氧 ，引起胃癌相关的DNA 损伤和炎症反应[9]；大肠杆菌（escherichia coli，E.coli）可产生大肠杆菌素和细胞致死性膨胀毒素，损伤细胞DNA，引起基因组不稳定，促进胃癌前病变的形成[10]；“新一代益生菌”嗜黏蛋白阿克曼菌（akkermansia muciniphila，Akk）可分解黏蛋白，会释放营养物质，影响肠道菌群结构及代谢功能，抑制炎症反应[11]。

本研究通过比浊法探究慢痞消组方中各味中药对益生菌Akk 和条件致病菌E.coli 和E.fa 的增殖影响，通过聚类分析各味中药调控菌群的药效作用特点，为从调节肠道菌群平衡的角度探究慢痞消治疗胃癌前病变的药效物质基础及作用机制研究提供参考。

1 材料与试剂

1.1 仪器与设备 旋转蒸发仪，迪图生物科技有限公司，型号：N-1300V-W。多功能酶标仪，帝肯贸易有限公司，型号：Infinite 200 pro。测序仪，Applied Biosystems，型号SeqStudio。梯度 PCR 仪，BIO-RAD，型号：T100。基因扩增仪，美国Bio-Rad，型号：TC-96/G/H（b）B。多功能成像系统，美国GE，型号：AI680。

1.2 试剂与耗材 试剂：革兰氏染色液试剂盒，海博，型号：HB8278；脑心浸出液肉汤（BHI），海博，型号：HB8297-1，均购自北京拜尔迪生物技术有限公司。细菌基因组DNA 提取试剂盒，天根生化科技有限公司，型号：DP302。TaKaRaTaq™Vers，Takara，型号：R004A，均购自河南省工业微生物菌种工程技术研究中心。中药饮片：香橼购自亳州市永刚饮片厂。丹参、炙甘草均购自北京市双桥燕京中药饮片厂。生白术、玫瑰花、玉竹、醋延胡索、砂仁、乌梅、白花蛇舌草、太子参、紫苏梗均购自北京本草方源药业集团有限公司。菌株：Akk 菌株、E.coli 菌株、E.fa 菌株均购自北纳生物科技有限公司。

2 方法

2.1 慢痞消各味中药提取液的制备 称量12 味中药各100 g，分别加入1 000 mL蒸馏水浸泡30 min，煎煮1.5 h，用200目滤布过滤，药渣重复煎煮过滤，合并2次滤液，5 000 rpm 离心10 min，取上清液减压浓缩冷冻干燥。

2.2 菌株培养、镜检并绘制生长曲线 用平板四区划线法将3 种菌培养，次日接种于液体培养基，250 rpm 37℃恒温摇床过夜。再取菌液接种于液体培养基中培养3 d。取菌液和50%甘油按照1:1 混合冻存。将三株菌液分别接种于6 孔板中，设置实验组和培养基对照组，从0 h 开始每隔2 h 测定2 组OD 600 nm 值，绘制生长曲线。按照革兰氏染色试剂盒说明书步骤对菌株进行染色观察。

2.3 细菌基因测序鉴定 按照天根细菌基因组提取试剂盒说明书步骤提取3 种菌基因组。DNA 片段用琼脂糖凝胶电泳检测纯度，120 V 恒压于电泳液30 min，紫外成像观察。用PCR 扩增试剂盒进行目的基因扩增，细菌16 s rRNA 基因的前/后引物由通用生物进行合成，序列5’to3’：27F 和1492R，产物大小1 500 bp。将提取的DNA 放入PCR 扩增仪中扩增反应，预热98℃2 min；循环98 ℃10 s；49 ℃30 s；72 ℃60 s 共30 个；最终延伸72℃5 min 并测序分析。PCR 产物电泳检测，100 V 恒压于电泳液40 min，紫外成像观察。PCR 扩增产物进行双向测序并拼接结果，登录NCBI进行BLAST-N 比对序列相似度。

2.4 比浊法检测慢痞消各味中药对三株菌的增殖影响 将各浓度中药药液、菌液和液体培养基混合均匀接种于96 孔板中，12 味中药冻干粉稀释成2.5、1.25、0.625、0.313、0.156、0.078、0.039 mg/mL 共7 个浓度。设置实验组、菌液对照组（无药液）和培养基空白对照组。培养后600 nm 下测定各组OD 值。

2.5 数据分析及慢痞消各味中药对三株菌调节作用的药效规律分析 实验数据均用Graph Pad Prism 9.5.1 统计分析，数据均为3 次独立实验结果，各组统计结果用均数±标准差（±s）描述表示。P＜0.05 为差异具有统计学意义。选择1.25、0.625、0.313、0.156、0.078 mg/mL 各味中药对三株菌的增殖结果进行聚类分析。

3 结果

3.1 镜检结果 Akk复活4 d平板菌层明显，菌落典型，菌落0.5 ～1 mm，圆形边缘不整齐，不透明，灰白色，中间凸起，表面光滑；E.coli 复活18 ～24 h 平板菌层明显，菌落典型，菌落2 ～4 mm，圆形边缘整齐，不透明，淡黄色，中间凸起，表面明亮光滑；E.fa 复活24 h 平板菌层明显，菌落典型，菌落1 ～2 mm，圆形边缘整齐，不透明，灰白色，中间凸起，表面明亮光滑。三株菌质地湿润易挑起，复活性均良好。染色后Akk和E.coli 呈红色，为革兰氏阴性菌，E.fa 呈蓝色，为革兰氏阳性菌。

3.2 生长曲线 Akk、E.coli 和E.fa 分别在48、4 和2 h 进入对数期，96、8 和8 h 达到平台期，故后续实验分别培养48、6 和4 h，见表1。

3.3 鉴定结果 三株菌分别经DNA提取、凝胶电泳（图1A）、基因扩增、凝胶电泳（图1B）和测序分析，序列比对一致性分别达99.14%、100%、99.58%，分别鉴定为Akk、E.coli 和E.fa 菌株无误。

3.4 慢痞消各味中药促进Akk 的增殖、抑制E.coli 和E.fa 的增殖 选0.625、0.313、0.156 mg/mL 中药对各菌增殖OD值进行分析发现，白术、丹参、炙甘草、玫瑰花、砂仁、太子参、玉竹等中药能明显促进Akk增殖（表2）；白术、丹参、玫瑰花、乌梅、香橼、玉竹、紫苏梗等中药能明显抑制E.coli 增殖（表3）；炙甘草、玫瑰花、砂仁、太子参、乌梅、香橼、玉竹、紫苏梗等中药能明显抑制E.fa 增殖（表4），并呈现一定的剂量依赖性。3.5 聚类分析结果 慢痞消各味中药对三株菌的调节作用被聚为三类（如图2）：1）紫苏梗、香橼、醋延胡索、白花蛇舌草、玫瑰花、丹参、砂仁，有理气活血、祛瘀解毒的祛邪作用；2）玉竹、太子参、甘草、乌梅，有益气和中、养阴生津的扶正作用；3）白术有补气燥湿和中，即扶正祛邪作用。

图2 慢痞消各味中药对三株菌的增殖水平聚类分析

注：A.细菌基因提取电泳检测图；B.PCR 产物电泳图，1-10.菌株

表2 慢痞消各味中药作用嗜黏蛋白阿克曼菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

表3 慢痞消各味中药作用大肠杆菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

表4 慢痞消各味中药作用粪肠球菌的增殖OD600 nm 值 mg/mL

4 讨论

慢痞消中太子参水煎液可通过提高有益菌丰度、显著降低有害菌丰度治疗脾虚型大鼠[12]。丹参提取物通过影响拟杆菌酶、厚壁菌门丰度缓解小鼠E.coli 感染[13]。玉竹多糖促进乳杆菌生长，抑制E.coli 生长[14]。白术多糖能缓解腹泻，增加大鼠有益菌丰度，降低有害菌丰度[15]。中、低剂量乌梅水煎液显著上调因抗生素而失调的菌群中乳杆菌属和粪杆菌属的相对丰度[16]。砂仁水煎液亦能恢复肠道菌群失调[17]。甘草水提物能增加BALB/c 小鼠粪便菌群中厚壁菌门丰度，降低拟杆菌门和变形菌门丰度[18]。本研究结果进一步显示：慢痞消中白术等能明显促进Akk 增殖。乌梅等能明显抑制E.coli 和E.fa 增殖，经聚类分析发现与其扶正祛邪药效之间存在一定相关性。

中药及复方口服后经消化道肠道菌群的生物转化，吸收入血发挥药效作用。基于中医整体观思想调控肠道菌群平衡探究中药及复方的药效物质基础，值得深入研究以揭示其科学内涵。