高效液相色谱-高分辨质谱法快速筛查动物源性药食同源产品中32 种抗生素兽药残留

周雪莼，胡婷婷，王佳慧，白 静，杨 颖，侯 宇，张 哲*，张 勋*

（1.长春中医药大学吉林省人参科学研究院，长春 130117；2.长春海关技术中心，长春 130062；3.吉林省吉测检测技术有限公司，长春 130117）

“药食同源”产品是以国家颁布的药食同源目录生产的保健食品[1-2]，介于保健品与药品之间，既有药品的治疗又有食品的安全稳定性[3-5]。吉林省动物源性药食同源特色产品包括：鹿胎膏、蜂蜜、鹿茸等产品。近年，“药食同源”产品的需求日益增多，但这些产品很多在生产、储存、运输过程中抗生素类兽药残留严重[6-7]，这对食用这些产品的人们健康造成巨大危害[8-11]，并且缺乏可靠的快速检测技术手段。建立一种兽药抗生素药物残留的分析方法是非常必要的。

目前，动物源性药食同源产品中残留抗生素类兽药常用的检测技术主要有微生物抑制检测法[12]、免疫分析法[13-14]、高效液相色谱法[15]、传感器检测法[16]、薄层色谱法[17]、近红外光谱法[18]、液相色谱-质谱法等[19-22]。但是上述方法依然存在操作复杂、耗时长、假阳性率高等问题，限制了其在快速检测中的发展和应用[23-26]，高分辨质谱具备灵敏度高、准确度高、检测速度快及假阳性率低等特点[27-29]，弥补了上述方法的劣势，填补了动物源性药食同源产品中抗生素类兽药快速筛查数据库的空白，尤其在无标准品的情况下能同时对大量样品中的多种或多类别待测物质进行高通量非靶向筛查确证，为动物源性药食同源产品中抗生素类兽药的快速筛查提供了新方法。本研究选取了吉林省生产经营过程中使用频率较高的β-内酰胺类、林可酰胺类、大环内脂类、硝基咪唑类、喹诺酮类、磺胺类、氯霉素类7 类共32 种抗生素兽药进行研究，并建立了对具有吉林省特色的鹿胎膏、蜂蜜和鹿茸样品基质为代表的动物源性药食同源特色产品32 种抗生素类兽药残留的快速前处理技术、基于高效液相色谱-高分辨质谱法高效筛查库，在缺乏标准品的条件下，快速准确筛查抗生素类兽药残留，为动物源性药食同源产品的质量控制和监管提供技术支撑。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂 Dionex Ultimate 3 000 RSLC-Q-Exactive型静电场轨道阱高分辨质谱仪（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、Hypersile Gold C18 色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm）（美国Thermo Fisher Scientific 公司）、Trace Finder 2.5 软件系统；Syncore 型天平（0.01 g，瑞士Precisa 公司）；TurboVap II 型氮气浓缩仪（美国Organomation公司）；AS10200-10L型超声波清洗器（天津，奥特赛恩斯仪器有限公司）；Allegra X-22R 型高速冷冻离心机（美国Beckman Coulter 公司）。

鹿茸、鹿胎膏和蜂蜜均来自于长春海关技术中心的待检测样品。

乙腈、甲醇、甲酸、乙酸铵（质谱纯，美国Thermo Fisher Scientific 公司）；PRiME HLB 固相萃取柱（美国Waters 公司）； 氨苄青霉素、头孢噻肟、头孢噻呋、头孢氨苄、头孢洛宁、头孢匹林、林可霉素、克林霉素、红霉素、交沙霉素、螺旋霉素、甲硝唑、氟甲喹、萘啶酸、诺氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、沙拉沙星、司帕沙星、洛美沙星、麻保沙星、丹诺沙星、双氟沙星、依诺沙星、恩诺沙星、环丙沙星、苯甲酰磺胺、磺胺醋酰、磺胺氯哒嗪、磺胺嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、氟苯尼考32 种兽药标准品（纯度均≥95%，德国Dr.Ehrenstorfer 公司）。实验用水为Millipore 系统制造的高纯水（≥18 MΩ·cm）。

1.2 标准溶液的配置 用甲醇对32 种抗生素兽药的混合标准溶液进行稀释，配置浓度为10 ug/mL、20 ug/mL、100 ug/mL 的混合标准溶液，避光保存。作为建立标准谱库及方法学考察的标准工作液。

1.3 样品的制备与保存 鹿茸：将样品（不少于200 g）置于高速粉碎机中研磨粉碎后过80 目筛，混合均匀后标记，置于常温下密封保存。蜂蜜和鹿胎膏：置于常温下密封保存。

1.4 样品的前处理

1.4.1 样品的提取 选用不同比例的乙腈-水和甲醇-水混合溶液对样品进行提取，每组设定3个平行试验，其提取步骤如下：用天平分别准确称取待测样品2.00 g，加入1 mL 纯水浸润样品（蜂蜜、鹿胎膏用温水搅拌至完全化开），分别加入10 mL 乙腈、75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水溶液、甲醇、75%甲醇-水、45%甲醇-水溶液后，旋涡震荡1 min，超声波清洗器萃取20 min，10 000 r/min 离心5 min 后，待净化。

1.4.2 样品的萃取 设定不同超声萃取时间对样品进行萃取，每组设定3 个平行试验，步骤如下：准确称取2.00 g 鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜样品，分别向其中添加0.01 mg/kg 的32 种兽药的混合标准溶液，按照1.4 方法处理，并分别超声提取5、10、20、30、40 min。

1.4.3 样品的净化 取超声后上清液直接加载到PRiME HLB 固相萃取柱（60 mg，3 mL 或相当者）上，无需活化和平衡，保持每秒1 滴的流速，收集全部流出液。取5.00 mL 流出液氮吹至体积小于0.5 mL，氮吹期间温度为40℃，将得到的液体用10%甲醇水溶液定容至1.00 mL，过0.22 μm 微孔滤膜（尼龙）后用于分析测定。

1.5 HPLC-MS 条件

1.5.1 色谱条件 采用Hypersile Gold C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm）； 流动相：水相（A）为含5 mmol/L 乙酸铵的0.1%甲酸水溶液；有机相（B）为甲醇，其中进样体积为10 µL，流速为0.3 mL/min，柱温为30℃。色谱流动相的洗脱梯度表，见表1。

表1 色谱流动相的洗脱梯度表

1.5.2 质谱条件 质谱的离子源参数： 喷雾电压（+）为3 200 V，离子传输管温度为325℃，鞘气为40 arb，辅助气为10 arb，探针加热器温度为350℃，S-透镜射频水平为60 V。质谱扫描参数： 扫描模式为Full MS-ddMS2，全扫描范围为80 ～1 000 m/z，分辨率为70 000，Full MS，17 500，MS/MS，自动增益控制为1e6，Full MS，2e5，MS/MS，循环次数： 6，MSX 计数：1，隔离宽度为2.0 m/z，碰撞能量分别为20、40、60 V，压缩比率为1%，顶点触发为2 ～6 s，动态排除为8 s。

1.6 标准分析数据库筛查设置 采用高效液相色谱-静电场轨道肼高分辨质谱对配制的32 种化合物的标准物质溶液（1 mg/L）在Full MS-ddMS2Scan 模式下对目标化合物进行一级质谱全扫描，通过高分辨质谱获得32 种化合物的分子量、保留时间、碎片离子等信息建立一级标准谱库。采用Trace Finder 2.5数据库筛查方法，设置方法：1）加载数据库（含32 个化合物，包含化合物名称、分子式、分子量、保留时间、碎片离子等信息）。Method Development →Compound Database →打开“pesticides database”；2）加载筛查方法：Method Development →Method View →打开“pesticides screening”；3）在筛查方法pesticides screening 中勾选数据库pesticides database，保存，建立batch，分析数据发现其母离子强度达到设定阈值（1×106）时，自动触发二级质谱扫描，同时得到母离子的精确质量数以及二级质谱的全扫描信息。采用20 eV、40 eV、60 eV 三个碰撞能量对化合物进行碎裂，得到一张碎片离子信息丰富的加和图。由于化合物峰形较窄，为避免出现二级离子打不到的情况，根据峰宽肩动态排除时间设置为3 s。获得二级谱图后利用软件计算碎片离子的分子量，与相应抗生素类兽药的相关信息关联，最终完成32 种抗生素类兽药的色谱库和质谱图的谱库构建。

1.7 实际样品的筛查测定 参考欧盟评分制方法指南筛查样品中目标物质是否存在，同时进行数据库验证。准确称量鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜3 种样品，分别作为空白阴性样品（不含有待测目标化合物）10 份、阳性添加样品各20 份（对鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜样品添加上述32种兽药标准品的混合溶液，添加浓度为0.01 mg/kg），按照实验方法筛查待测的32 种抗生素兽药。假阳性率（%）、假阴性率（%）按照下面公式。1）假阳性率=（获得筛查阳性结果的阴性样品数/阴性样品总数）×100%；2）假阴性率=（获得筛查阴性结果的阳性样品数/阳性样品总数）×100%。

依据欧盟SANTE 11813/2017 法规要求，对目标物样品进行一级全扫描，根据所建立的谱库数据定性分析依据保留时间、母离子精确质量数和一个碎片离子精确质量数（或两个母离子精确质量数）。在相同条件下，样液中待测化合物保留时间与谱库中保留时间的相对偏差≤±2.5%（且不超过0.5 min）或≤0.2 min，所监测定性离子的信噪比S/N ≥3，母离子精确质量数与理论质量数的相对偏差≤5 ppm（1×10-6），一个二级碎片离子精确质量数的相对偏差≤10 ppm，则可以初步判断实验中含有该种化合物。在空白样品中添加筛查浓度标准溶液，作为质控样品。样品中目标化合物检测浓度大于等于方法筛查限时判定为阳性结果。

2 结果

2.1 样品前处理方法的优化

2.1.1 提取溶剂的选择 本研究分别对不同比例的乙腈-水和甲醇-水混合溶液进行了考察，使用甲醇为提取溶剂时，提取率不高仅为46%～58%，且提取液中含有较多杂质，用乙腈及乙腈-水混合溶液作为提取溶剂时，一方面能保证较高的待测物提取率，另一方面，乙腈极性大、穿透力强，可有效沉淀样品中的大量蛋白质及其他非极性磷脂类干扰物，尽可能地减少在测定过程中的基质干扰，故最终选用乙腈作为提取溶剂。随即对比100%乙腈、75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水溶液的提取效果，结果表明，使用75%乙腈-水、60%乙腈-水、45%乙腈-水、30%乙腈-水为提取溶剂时，提取率范围约为54%～66%、46%～52%、35%～43%、26%～32.5%。并且随着体系中水的占比不断升高时，溶液在浓缩步骤处于比较难于悬至近干的状态。当用100%乙腈进行提取时，待测物的提取率范围为77%～84%，提取液较澄清且得到的色谱图中未知物的杂峰数量有所减小，基本不影响32种待测物的检测，故最终选用100%乙腈作为提取溶剂。

2.1.2 超声时间的选择 超声波具有极端的物理特性，其机械效应、空化效应及热效应等能够对物质能产生很强的破坏作用，能促使细胞组织破壁变形[30]，可有效提高提取效率。因此，本研究比较了超声处理5、10、20、30、40 min 的提取效率。准确称取一定量的鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜，分别向其中添加0.01 mg/kg水平的32 种兽药的混合标准溶液，按照1.4 方法处理，并分别超声提取5、10、20、30 和40 min。结果显示，当超声提取5 min、10 min 时，提取率范围约为28%～39%和48%～62.5%，当超声提取20 min 时，32 种兽药的提取率均能够达到最高，提取率范围约为76%～85%，20 min 后，提取时间的延长对32 种兽药的提取率的影响已不显著，当超声提取30 min、40 min时，提取率范围约为77%～85%和78%～86.5%，故最终确定超声提取时间为20 min。

2.2 HPLC-HRMS 条件的优化 本研究比较了2 组不同流动相的分离效果：流动相A 为纯水和含5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸水溶液，流动相B 为甲醇、乙睛及含5 mmol/L乙酸铵的0.1%甲酸的水溶液。结果表明，在流动相中加入5 mmol/L 乙酸铵溶液可以流动相能够保持一定的离子强度，以改善峰形，减少峰拖尾。使用甲醇为流动相B 时，待测物的响应强度更高，峰型更好，而且鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜中基质复杂，甲醇能更好地洗脱，减少污染，延长了仪器和色谱柱的使用寿命。虽然采用甲醇时柱压较乙腈高，但对目标物响应值更高。

2.3 筛查数据库的建立 配制混合标准溶液，依据建立好的色谱条件（1.5.1）和质谱条件（1.5.2）进样，准确输入32 种抗生素兽药的英文、CAS 号、中文名称及化学式，由高分辨质谱数据库构建软件Trace Finder 2.5 计算得到每种化合物的理论质量数。而后在采用数据依赖性二级质谱扫描（ddms2）的同时使用动态排除模式，当列表中的母离子响应强度达到设定阈值，自动采集二级数据；在三个碰撞能量下（20/40/60eV）对目标物进行碰撞，加和获得二级谱图，利用软件计算主要二级碎片精确分子量，与相应化合物的保留时间、精确质量数测定值、中英文名称、CAS 号、分子式等信息相关联，最终完成32种抗生素类兽药的谱库构建，见表2。

表2 32 种抗生素类兽药的分子式、保留时间、母离子和特征碎片离子质量

2.4 定性方法 按照欧盟SANTE 11813/2017 法规，定性分析依据化合物的保留时间、母离子精确质量数和一个碎片离子精确质量数（或2个母离子精确质量数）。在相同条件下，样液中待测化合物保留时间与谱库中保留时间的相对偏差≤±2.5%（且不超过0.5 min）或≤0.2 min，所监测定性离子的信噪比S/N ≥3，母离子精确质量数与理论质量数的相对偏差≤5 ppm（1×10-6），一个二级碎片离子精确质量数的相对偏差≤10 ppm，则可以初步判断实验中含有该种化合物。在空白样品中添加筛查浓度（0.01 mg/kg）混合物标准溶液作为质控样品。样品中目标化合物检测浓度大于等于方法筛查限时判定为阳性结果。利用Tract Finder 2.5 软件对化合物定性筛查，符合设定范围的样品即为阳性样品。实验条件相同时，如果色谱峰的保留时间与数据库相对应，扣除背景后的质谱图所选择的离子及其相对丰度与数据库相对应，则可证明样品中存在这种抗生素类兽药或与之相关的其他化学物质。

2.5 实际样品的测定验证 鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜所有阴性样品的假阳性率均为0，在检测鹿胎膏中残留的喹诺酮类药物环丙沙星时，假阴性率为5%。经5 家单位技术人员进行验证实验，即对鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜样品添加上述32 种兽药标准品的混合溶液，添加浓度为0.01 mg/kg，经验证结果表明，上述32 种抗生素兽药在样品中均被定性检出，准确率为100%。说明本方法准确率高、灵敏度较好，适用于7 类共计32 种抗生素兽药的同时快速筛查。

3 小结

本研究通过优化样品的前处理方法及色谱和质谱条件，建立了同时检测动物源性药食同源产品（鹿茸、鹿胎膏、蜂蜜）中32 种抗生素类兽药残留的快速筛查方法。通过简便的样品前处理方法，无需标准品即可实现7 类共32 种兽药残留的同时筛查，而且能够满足法规限量要求的灵敏度。假阳性率和假阴性率满足《食用农产品化学物质残留高通量筛查方法确认与检测质量控制指南》中对于筛查方法的性能要求，实际样品经5 家单位的实验验证后，准确率为100%，检出限为0.01 mg/kg。这使得动物源性药食同源产品的多残留分析检测效率迈向了新的台阶，对动物源性药食同源产品的安全质量监管提供了重要的成熟筛查技术手段。若想更进一步研究动物源性药食同源产品中的兽药残留，还需不断补充兽药种类，进而为动物源性药食同源产品的安全保证提供有力支撑。