枯草芽孢杆菌肽聚糖对绵羊瘤胃上皮细胞 β-防御素-1 (SBD-1)表达的影响

齐 盟 , 辛雅明 , 白绥明 , 胡 亮 , 杨银凤

(1. 内蒙古农业大学兽医学院 , 内蒙古 呼和浩特 010018 ; 2. 内蒙古自治区基础兽医学重点试验室 , 内蒙古 呼和浩特 010018 ; 3. 内蒙古鄂尔多斯市动物疫病预防和控制中心 , 内蒙古 鄂尔多斯 017000 ;4. 巴彦淖尔市农牧业科学研究所 , 内蒙古 巴彦淖尔 015000)

我国农业农村部发布194号公告,规定自2020年1月1日起,饲料中禁止添加抗生素[1]。抗生素添加在饲料中虽然可以发挥预防肠道疾病、降低患病率、增加饲料利用率和促进生长等作用,但同时导致了畜体抗生素残留、耐药菌产生等问题[2]。解决上述问题成为了当前科研人员共同关注的焦点。在科研人员的不断探索中发现,在饲料中添加益生菌、中草药和后生元等物质可以有效提高动物免疫能力[3]。后生元是在益生元基础上发展而来的新概念,由灭活的益生菌细胞成分和代谢产物组合而成,在刺激天然免疫、调节肠道菌群和保护肠道黏膜完整性等方面发挥的作用可与益生菌比肩,但后生元发挥作用的机理还有待进一步研究和证实[4]。

防御素是抗菌肽家族中的一种,作为天然免疫中不可或缺的一部分,其在机体内发挥着抗菌、抗病毒和抗肿瘤等作用[5,6]。研究发现,防御素可以阻止病原微生物进入呼吸道、阴道和肠道,降低感染性疾病的发病率[7]。目前,大量生产有活性的防御素仍是技术和经济难题[8],所以诱导机体表达防御素,成为实现提高动物免疫能力、预防疾病和辅助治疗疾病的潜在方法[9]。绵羊体内共有2种β-防御素,即绵羊β-防御素-1(Sheep β-defensin-1,SBD-1)和SBD-2。SBD-2仅在舌和回肠远端表达,而SBD-1在整个消化道中均有表达,且在瘤胃中表达量最多[10]。

枯草芽孢杆菌作为饲料中益生菌添加剂已经被广泛应用,但有关枯草芽孢杆菌后生元产品的报道却少见。枯草芽孢杆菌细胞壁中的主要成分为肽聚糖和磷壁酸,肽聚糖是免疫反应中的重要抗原,也是后生元的重要组成成分[11]。有研究表明,益生菌肽聚糖可以有效保护胃肠道黏膜的健康[12],而致病菌肽聚糖则会刺激动物组织产生炎症[13]。枯草芽孢杆菌肽聚糖是否能够作为后生元的组成成分参与免疫调节,诱导绵羊防御素的表达未见报道。因此,本试验以枯草芽孢杆菌肽聚糖和绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine rumen epithelial cells,ORECs)为对象,通过实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),探究枯草芽孢杆菌肽聚糖诱导ORECs表达SBD-1的规律,对肽聚糖作为新型饲料添加剂和后生元使用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料 于内蒙古呼和浩特市玉泉区北亚屠宰场选取12月龄左右的健康蒙古绵羊,裁取5 cm×5 cm 大小的瘤胃组织块,使用含双抗的磷酸缓冲液(Phosphate belanced solution,PBS)冲洗,冲洗干净后撕掉肌层和浆膜层,浸泡于含双抗的PBS中备用。

1.2 主要仪器 CO2培养箱,Thermo公司产品;倒置荧光显微镜,Nikon ECLIPSE公司产品;普通PCR仪,Labcycler公司产品;qPCR仪,ABI公司产品;多功能酶标仪,Biotek公司产品。

1.3 主要试剂 枯草芽孢杆菌肽聚糖,购自Sigma公司;DMEM/F12培养基,购自Glibco公司;总RNA提取试剂盒,购自Axygen公司;反转录试剂和荧光定量PCR酶,均购自TaKaRa公司;绵羊防御素β1(DEFβ1)ELISA试剂盒,购自武汉新启迪生物科技有限公司。

1.4 ORECs培养 在金鑫等[14]建立的ORECs培养方法上改进(缩短消化时间,免除过度消化对细胞带来的影响)并培养细胞。将F3代ORECs以1×107个/mL接种于6孔板和96孔板中,加入DMEM-F12基础培养基饥饿处理(使细胞不再分裂增殖并处于相同生长周期内)。处理好的细胞用于后续的刺激试验和细胞毒性试验。

1.5 不同时间条件下肽聚糖对ORECs的刺激试验 取出饥饿处理后的6孔板细胞,使用PBS清洗3次,对照组加入DMEM-F12基础培养基2.5 mL,试验组加入30 μg/mL肽聚糖溶液2.5 mL,分别刺激2、4、6、8、10和12 h。

1.6 不同浓度肽聚糖对ORECs的刺激试验 取出饥饿处理后的6孔板细胞,使用PBS清洗3次,对照组加入DMEM-F12基础培养基2.5 mL,试验组分别加入10、20、30、40和50 μg/mL 肽聚糖溶液2.5 mL,刺激2 h。

1.7 qPCR检测刺激ORECs中SBD-1 mRNA的表达量 按照总RNA提取试剂盒说明书操作,提取1.5和1.6各组细胞的RNA,并反转为cDNA。使用多功能酶标仪将得到的cDNA调节至1 μg/μL,以β-actin为内参基因,SBD-1为目的基因设计引物(表1),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司设计合成,通过qPCR检测ORECs中SBD-1 mRNA的相对表达量。反应总体系为20 μL:ROX 0.4 μL,ddH2O 6 μL,上游引物(10 μmol/L) 0.8 μL,下游引物(10 μmol/L) 0.8 μL,cDNA模板 2 μL,TB Green 10 μL。反应程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 34 s,45个循环;熔解程序:95 ℃ 5 s;60 ℃ 30 s,95 ℃ 15 s。试验数据使用2-ΔΔCt法计算mRNA相对表达量。

表1 引物信息Table 1 Primer details

1.8 ELISA检测刺激上清中SBD-1蛋白的表达量 按照绵羊防御素β1 (DEFβ1) ELISA试剂盒说明书操作,检测1.5和1.6各组培养基中(3 000 r/min离心10 min,取上清)SBD-1蛋白的表达量。

1.9 CCK-8细胞毒性试验 取出饥饿处理后的96孔板细胞,刺激操作同方法1.5和1.6,之后每孔加入10 μL CCK8溶液,37 ℃、5% CO2培养箱中孵育1.5 h。最后使用多功能酶标仪于450 nm处检测光密度(Optical density,OD)值,计算细胞存活率。

1.10 统计分析 试验数据使用“平均值±标准差”表示,使用GraPhPad Prism 8.01对试验结果进行单因素方差分析,P<0.05表示有统计学差异,P<0.01表示差异显著,P<0.001表示差异极显著。

2 结果

2.1 ORECs培养 培养0 d的ORECs未贴壁,细胞呈点状悬浮于培养基中(图1A)。培养3 d后,细胞呈岛屿状分布(图1B)。培养5 d后,细胞在3 d的基础上呈辐射状生长(图1C)。培养7 d后,细胞呈大理石铺路状,分布均匀,界限清晰(图1D)。

图1 ORECs原代细胞培养Fig.1 Primary culture of ORECsA:培养0 d; B:培养3 d; C:培养5 d; D:培养7 dA:Cultured for 0 d; B:Cultured for 3 d; C:Cultured for 5 d; D:Cultured for 7 d

2.2 不同时间条件下肽聚糖对ORECs中SBD-1 mRNA表达量的影响 如图2所示,qPCR扩增曲线无异常,扩增效果良好,熔解曲线无杂峰,分别在88.5 ℃和84.0 ℃出现单一峰,主峰对应熔解温度(Melting temperature,Tm)与引物预期Tm相同。如图3所示,肽聚糖刺激ORECs不同时间后,各试验组SBD-1的mRNA相对表达量均极显著高于对照组(P<0.001);在2 h时SBD-1的mRNA相对表达量最多,之后表达量随时间延长呈先降低后升高的趋势。

图2 β-actin和 SBD-1基因qPCR扩增曲线和熔解曲线(n=3)Fig.2 qPCR amplification curve and melting curve of β-actin and SBD-1 genes(n=3)A:β-actin扩增曲线; B:SBD-1扩增曲线; C:β-actin熔解曲线; D:SBD-1熔解曲线A:β-actin amplification curve; B:SBD-1 amplification curve; C:β-actin melting curve; D:SBD-1 melting curve

图3 不同时间条件下肽聚糖对ORCEs中SBD-1 mRNA 表达量的影响(n=3)Fig.3 Effects of peptidoglycan on SBD-1 mRNA expression levels in ORCEs under different times (n=3)与对照组(0 h)相比,***:P<0.001Compared with the control group (0 h), ***: P<0.001

2.3 不同浓度肽聚糖对ORECs中SBD-1 mRNA表达量的影响 如图4所示,不同浓度肽聚糖刺激ORECs 后,除10 μg/mL试验组外,其他试验组SBD-1的mRNA相对表达量均极显著高于对照组(P<0.001),呈先升高后降低的趋势,当肽聚糖浓度为20 μg/mL时SBD-1的mRNA相对表达量最多。

图4 不同浓度肽聚糖对ORCEs中SBD-1 mRNA表达量的影响(n=3)Fig.4 Effects of peptidoglycan on SBD-1 mRNA expression levels in ORCEs under different concentrations (n=3)与对照组(0 μg/mL)相比,***:P<0.001Compared with the control group (0 μg/mL), ***: P<0.001

2.4 不同时间和不同浓度肽聚糖对ORECs上清中SBD-1蛋白表达量的影响 如图5所示,肽聚糖浓度同为30 μg/mL,当刺激时间为2 h时,SBD-1蛋白表达量达到最多并极显著高于对照组(P<0.001)。刺激时间同为2 h,当刺激浓度为20 μg/mL时,SBD-1蛋白表达量达到最多并极显著高于对照组(P<0.001)。

图5 不同时间(A)和不同浓度(B)肽聚糖对ORECs上清中SBD-1蛋白表达量的影响(n=3)Fig.5 Effects of peptidoglycan on SBD-1 protein expression levels in ORECs supernatant At different times (A) and concentrations (B) (n=3)与对照组相比(0 h/0 μg/mL),**:P<0.01,***:P<0.001Compared with the control group (0 h/0 μg/mL),** : P<0.01,***: P<0.001

2.5 CCK8细胞毒性试验 如图6所示,不同时间和不同浓度肽聚糖刺激ORECs后,各试验组与对照组相比无统计学差异,表明枯草芽孢杆菌肽聚糖对ORECs无明显毒性作用。

图6 CCK8法检测不同时间(A)和不同浓度(B)肽聚糖对ORECs的毒性(n=3)Fig.6 Toxicity of peptidoglycan on ORECs at different times (A) and concentrations (B) detected by CCK8 assay (n=3)

3 讨论

随着饲料中“禁抗令”的实施,防御素作为潜在的抗生素替代品被科研人员关注。益生菌诱导防御素表达的研究不断增多,Singh等将8种罗伊氏乳杆菌及其外泌蛋白与Caco-2细胞共培养,发现灭活菌和外泌蛋白均能够诱导β-防御素表达[15]。Jia等的研究表明,使用鼠李糖乳杆菌及其肽聚糖与鸡胚小肠上皮细胞共培养,能够诱导鸡β-防御素-1的表达[16]。枯草芽孢杆菌作为普遍使用的微生物添加剂已经被证明能够提高动物免疫能力、抵抗感染和调节免疫[17]。机体识别细菌主要依靠病原相关模式分子,如肽聚糖、磷壁酸和脂多糖等[18]。也有研究表明,机体通过Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)识别肽聚糖产生防御素,激活先天性免疫,帮助机体清除病原体。长期使用低剂量的肽聚糖可以增强机体的生理功能,刺激各种细胞因子的产生,维护生命健康[19]。枯草芽孢杆菌细胞壁成分肽聚糖与防御素关系的研究少见报道,因此,本试验以ORECs为细胞模型,探究枯草芽孢杆菌肽聚糖诱导体外培养的ORECs表达SBD-1的最佳条件。

本试验结果显示,SBD-1的表达量呈浓度和时间依赖关系,20 μg/mL肽聚糖刺激时间2 h为肽聚糖诱导ORECs表达SBD-1的最佳条件。Jin等[20]和Zhang等[21]的研究表明,酿酒酵母菌甘露聚糖和β-葡聚糖最佳刺激条件分别为50 μg/mL刺激ORECs 4 h和10 μg/mL刺激ORECs 2～4 h。这可能是由于有效成分的结构、刺激信号和诱导机制不同,呈现出不同的浓度和时间的依赖关系。

不同浓度肽聚糖诱导ORECs中SBD-1的mRNA和蛋白表达量的试验结果显示,30、40和50 μg/mL试验组mRNA相对表达量均高于10 μg/mL试验组,但蛋白表达量相反,这可能是由于ORECs表面TLR-2受体有限,当肽聚糖过多时,受体与肽聚糖结合达到阈值,出现负反馈调节抑制SBD-1蛋白的合成,使SBD-1的表达量下降并恢复到接近正常状态,从而保证SBD-1在机内表达的动态平衡[22]。

CCK8毒性试验结果显示,不同刺激时间和刺激浓度的试验条件均不会对ORECs的活性产生影响,表明肽聚糖不会引起细胞活性下降或细胞死亡裂解等情况。有报道称,当肽聚糖浓度低于50 μg/mL,刺激时间不超过12 h,不会使细胞产生炎性反应[23]。并且肽聚糖的致炎作用与肽茎的第3个氨基酸有关,第3个氨基酸为L-赖氨酸则不表现出炎症反应,枯草芽孢杆菌肽聚糖肽茎第3个氨基酸为m-A2pm。枯草芽孢杆菌肽聚糖刺激ORECs 12 h后,SBD-1表达量升高可能与产生炎性有关[24,25]。但本试验中枯草芽孢杆菌肽聚糖是否能够在不引起炎症因子表达的条件下调控免疫有待进一步研究证明。枯草芽孢杆菌肽聚糖主要通过哪种受体和信号通路诱导SBD-1表达的问题还有待进一步解决。

综上所述,枯草芽孢杆菌肽聚糖作为免疫刺激物可以在体外诱导ORECs产生SBD-1。本试验是在体外进行的,体外试验得出的最佳刺激条件与体内试验是否一致还需要进一步的探究和阐述。本试验为益生菌诱导防御素产生提供新证据,为枯草芽孢杆菌肽聚糖产品开发提供新思路。