肝胃百合汤对胃溃疡大鼠IRE1α信号通路的影响

阳凌峰,林瑞芳,杨 颖,谢 欣,喻 斌

(1.湖南中医药大学,湖南 长沙 410208;2. 湖南中医药大学第一附属医院,湖南 长沙 410007)

胃溃疡是发生在胃内壁黏膜的一种缺损性疾病,甚者病变可穿透肌层,或伴随胃出血、胃穿孔、癌变等急重并发症,严重影响人们的生活质量[1]。目前,胃溃疡的全球发病率高达5%～10%[2],其发生的主要原因可能是机体各种防御机制与致病因素间的失衡[3],常见外源性致病因素有幽门螺杆菌感染、过量饮酒、长期摄入非甾体类抗炎药物(如吲哚美辛)等,尤其是非甾体类抗炎药物的不合理使用使得胃溃疡发病率在我国呈上升趋势[4]。因吲哚美辛诱导的大鼠胃黏膜急性损伤类似于胃溃疡患者的病变,故该动物模型已经被广泛用于评估各种天然药物的潜在胃肠道保护活性[5-7]。胃溃疡的发生机制复杂,相关研究认为过度或持续的内质网应激(ERS)会加重胃黏膜损伤,改善胃黏膜ERS可能是预防非甾体类抗炎药物诱导胃溃疡的一种潜在方式[8]。ERS是一种新型细胞凋亡方式,肌醇需求酶1α(IRE1α)信号通路作为ERS重要的途径之一,可能在发挥胃黏膜保护作用中占有重要地位[9-11]。肝胃百合汤由湖湘名老中医夏度衡教授根据“后天脾胃难离肝”的学术思想所创,临床上治疗胃溃疡疗效确切[12-14]。然其具体作用机制尚未明确,故本研究建立吲哚美辛诱导胃溃疡大鼠模型,从IRE1α信号通路介导的ERS角度探讨肝胃百合汤对大鼠胃溃疡的影响及其干预机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SPF 级SD大鼠36只,9～10周龄,体重240～260 g,购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司,动物许可证号:SCXK(湘)2019-0004。饲养于湖南中医药大学动物实验中心,饲养湿度40%～60%,室温25 ℃,自由饮水进食。实验由湖南中医药大学第一附属医院实验动物伦理委员会审查通过(ZYFY20230725-01)。

1.2药品和试剂 肝胃百合汤由百合15 g、柴胡10 g、川楝子10 g、乌药10 g、郁金10 g、丹参10 g、黄芩10 g、甘草6 g组成,湖南中医药大学第一附属医院提供;吲哚美辛肠溶片,临汾宝珠制药有限公司(国药准字H14022501);奥美拉唑肠溶片,无锡阿斯利康公司(批号:20170502) ;葡萄糖调节蛋白78(GRP78)抗体(货号:66574-1-Ig)、IRE1α抗体(货号:27528-1-AP)、凋亡信号激酶 1 (ASK1)抗体(货号:28201-1-AP)、β-actin抗体(货号:66009-1-Ig),美国proteintech公司;磷酸化肌醇需求酶1α(p-IRE1α)抗体(货号:ab124945)、胱天蛋白酶12(Caspase-12)抗体(货号:ab62484),英国abcam公司;山羊抗兔 IgG-HRP(货号:AWS0002)、5×蛋白上样缓冲液(货号:AWB0055)、Tris-HCl缓冲液(货号:AWB0073)、SDS溶液(货号:AWT0047),中国Abiowell公司;显影液(货号:BW-61)、定影液(货号:BW-62),上海佳信公司;伊红、苏木素、PBS(7.2～7.6)、DAPI,Wellbio公司。

1.3主要仪器 摇床(货号:TS-92,其林贝尔);TUNEL试剂盒(40306ES50,上海翊圣生物);切片机(货号:YD-315,浙江金华益迪试验器材);包埋机(货号:BMJ-A,常州中威电子仪器);电泳仪(货号:DYY-6C,中国北京六一);荧光显微镜(货号:BA410T,Motic);台式冷冻离心机(货号:H1650R,中国湖南湘仪)。

1.4实验方法 大鼠适应性喂养3 d后,按照随机数字表将36只大鼠分为空白组、模型组、奥美拉唑组、肝胃百合汤组,每组9只。根据体表面积(按人体重70kg算)计算出肝胃百合汤用药量为7.29 g/(kg·d),奥美拉唑(按成人每天剂量40 mg/d算)用药量为3.6 mg/(kg·d),用蒸馏水配制相应浓度溶液备用,灌胃容积为10 mL/kg。肝胃百合汤组和奥美拉唑组分别予以肝胃百合汤、奥美拉唑溶液预防性灌胃药1周,空白组、模型组灌胃等量蒸馏水。末次预防性给药前先禁食不禁水24 h,模型组、奥美拉唑组、肝胃百合汤组末次预防性给药1 h后予以单次灌胃溶于5%NaHCO3溶液的吲哚美辛80 mg/kg诱导胃溃疡[15],造模3 h后用10%异氟烷吸入麻醉大鼠并处死。

1.5检测指标及方法

1.5.1胃溃疡指数 根据Guth标准[16]对胃溃疡情况进行计分:无损伤记0分;损伤≤1 mm记1分;1 mm<损伤≤2 mm记2分;2 mm<损伤≤3 mm记3分;3 mm<损伤≤4 mm记4分;损伤>4 mm记5分;损伤宽度>2 mm,则胃溃疡指数加倍。通过3人同时评估取累计得分平均值为胃溃疡指数。

1.5.2胃黏膜病理形态 取4%多聚甲醛固定48 h后的胃组织样本,进行脱水、透明、石蜡包埋处理,切成4 μm薄片于60 ℃下烤片2 h,然后使用全自动染色机进行HE染色,经过中性树脂封片后在普通显微镜下观察拍照。

1.5.3胃组织细胞凋亡情况 取制备好的胃组织石蜡切片,按TUNEL细胞凋亡检测试剂盒说明书的操作方法对切片进行染色,并于荧光显微镜400倍视野下采集图片。

1.5.4胃组织中GRP78、IRE1α、p-IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表达情况 采用Western blot法检测:剪取0.025 g胃组织,加RIPA裂解液于冰上裂解10 min,在4 ℃下12 000 r/min(离心半径10 cm)条件下离心15 min后,取上清液,利用BCA法进行蛋白定量。将蛋白样本上样后,依次进行SDS-PAGE电泳、转膜,并在TBST缓冲液的孵育槽中进行室温下封闭90 min。加入GRP78(1：5 000)、IRE1α(1：500)、p-IRE1α(1：200)、ASK1(1：500)、Caspase-12(0.5～2 μg/mL)兔抗鼠一抗,4 ℃孵育过夜;加入羊抗兔二抗(1：2 000),室温孵育90 min。ECL显色后使用Quantity One软件分析灰度值。

1.6统计学方法 采用SPSS 25.0软件进行数据分析,若数据符合正态分布且满足方差齐性,采用单因素方差分析,反之则用Kruskal-WallisH检验。P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组胃组织溃疡情况 空白组大鼠胃黏膜表面光滑,未见溃疡、糜烂出血灶;模型组大鼠胃黏膜明显溃疡损伤,可见多个条索状血带,溃疡指数为49.00±12.32;奥美拉唑组和肝胃百合汤组大鼠胃黏膜均见少量条索状血带,或见斑点状、糜烂性出血,溃疡指数分别为29.44±15.65和27.11±10.98,均明显低于模型组(P均<0.05),肝胃百合汤组与奥美拉唑组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

2.2各组胃组织病理学形态 空白组大鼠胃组织黏膜层、黏膜下层、黏膜肌层结构完好无损、层次分明,腺体排列整齐,黏膜下层未见明显充血、水肿,未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠胃黏膜组织出现严重缺损,腺体结构紊乱,胃黏膜上皮细胞脱落,大量细胞死亡和炎性细胞浸润,黏膜下层出现明显水肿。与模型组比较,肝胃百合汤组和奥美拉唑组大鼠胃黏膜部分缺损,腺体排列有所改善,少量细胞死亡和炎性细胞浸润,轻度黏膜下水肿。见图1。

图1 空白组和胃溃疡各组大鼠胃组织病理形态(HE染色,×100)

2.3各组胃组织细胞凋亡情况 正常细胞DAPI染色细胞核呈蓝色,凋亡细胞呈绿色。与空白组比较,模型组胃组织绿色荧光强度明显增强,细胞凋亡数目明显增多;与模型组比较,肝胃百合汤组和奥美拉唑组胃组织绿色荧光强度减弱,细胞凋亡数目有所减少。见图2。

图2 空白组和胃溃疡各组大鼠胃组织细胞凋亡情况(TUNEL染色,×400)

2.4各组胃组织中GRP78、IRE1α、p-IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表达情况 模型组大鼠胃组织中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05),肝胃百合汤组和奥美拉唑组大鼠胃组织中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相对表达量均明显低于模型组(P均<0.05),肝胃百合汤组各蛋白相对表达量与奥美拉唑组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图3及表1。

图3 空白组和胃溃疡各组大鼠胃组织中GRP78、p-IRE1α/IRE1α、ASK1、Caspase12蛋白表达情况

表1 空白组和胃溃疡各组大鼠胃组织中GRP78、p-IRE1α/IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白相对表达量比较

3 讨 论

胃溃疡是常见的胃肠道疾病之一,以上腹部周期性、节律性疼痛为典型症状,胃黏膜表现为糜烂,甚至溃疡出血。临床主要以质子泵抑制剂、胃黏膜保护剂等治疗或预防,但长期服用常伴不良反应[17]。因此,寻找防治胃溃疡的新策略十分必要。中医药在防治胃溃疡方面具有多途径、多靶点等优势,为防治胃溃疡提供了一定的思路。中医将胃溃疡归属于“胃疡”“胃脘痛”等范畴,认为其病位在胃,与肝、脾二脏密切相关,贯穿着“肝胃不和”“肝胃郁热”之病机变化[18]。肝胃百合汤源自《夏度衡医案》,方取微凉之百合、郁金,性平之柴胡,微温之乌药疏肝理气和胃,且百合能顾护胃阴;因久病入络,血瘀气滞,易郁久化热,故取丹参、郁金活血化瘀,川楝子疏肝泄肝,黄芩清解胃热;甘草调和诸药。全方配伍严谨,不腻不燥,合而为之,共奏疏肝泄热和胃、活血化瘀止痛之功效。相关研究表明,肝胃百合汤可促进胃溃疡患者血清中转化生长因子-β1、表皮生长因子、三叶生长因子表达,从而加速患者溃疡创面修复[19-21]。

内质网是真核细胞内对蛋白质进行加工折叠的一种重要细胞器,当机体受到钙失衡、氧化还原反应等各种因素刺激导致内质网正常功能受损时,内质网腔内错误折叠或未折叠蛋白过度堆积,扰乱细胞内环境稳态而发生ERS[22]。适度的ERS会启动未折叠蛋白反应,恢复内质网蛋白折叠能力,从而维持细胞存活,而高强度的ERS会触发一系列凋亡信号引起细胞凋亡[23]。Kim等[24]研究表明,过度的ERS引起胃黏膜细胞凋亡可能是胃黏膜损伤的重要机制,抑制ERS可能是防治胃溃疡的有效靶点。GRP78是ERS的标志性蛋白,也是ERS发生的监测者。生理条件下,GRP78与内质网膜上的IRE1α蛋白感受器偶联而使IRE1α处于失活状态;ERS状态下,GRP78与IRE1α解离并使IRE1α自身磷酸化而激活,p-IRE1α通过激活下游生存与凋亡因子而调控细胞存活[25]。Caspase-12作为ERS的特异性蛋白,其活化是凋亡命令执行的关键环节,GRP78/IRE1α/ Caspase-12是Caspase-12蛋白酶活化的重要途径,活化的Caspase-12进一步激活Caspase家族蛋白而执行细胞凋亡命令[26]。研究表明,胃黏膜损伤时GRP78、Caspase-12蛋白处于高表达状态,通过抑制Caspase-12活化可减轻胃黏膜损伤[27-28]。ASK1是一种应激蛋白,其在内质网稳定状态下与IRE1α形成稳定复合物[29],而在应激状态下,ASK1通过激活下游c-Jun氨基末端激酶,从而调控各种凋亡基因表达而诱导细胞凋亡,在胃溃疡发展转归中扮演重要角色[30]。

本实验结果显示,模型组大鼠吲哚美辛造模后胃黏膜组织严重缺损,病变部位出现明显炎性细胞浸润,大量胃组织细胞凋亡,胃组织中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表达明显上调;肝胃百合汤组及奥美拉唑组胃黏膜损伤较轻,炎性细胞浸润及凋亡细胞较少,胃组织中GRP78、p-IRE1α/ IRE1α、ASK1、Caspase-12蛋白表达明显下调。表明肝胃百合汤可抑制胃黏膜细胞凋亡,其可能通过抑制IRE1α信号通路介导的ERS,进而对吲哚美辛诱导的胃溃疡大鼠胃黏膜发挥一定保护作用。本课题组将进一步建立高质量病症结合动物模型,探讨肝胃百合汤靶向ERS治疗胃溃疡的具体机制。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。