白术内酯Ⅰ对心肾综合征大鼠心肾功能的影响及机制

吴英智,李志梁,赖 俊,傅 强

(1. 深圳大学附属华南医院,广东 深圳 518116;2. 南方医科大学珠江医院,广东 广州 510280;3.广东省第二人民医院心血管病医院,广东 广州 510317)

心脏和肾脏间具有密切联系,其中一个脏器的功能紊乱会导致另外一个脏器功能继发性紊乱或损伤,心脏和肾脏间这种交互作用被称为心肾综合征[1]。相关研究报道,入院急性失代偿性心力衰竭患者约30%合并慢性肾脏疾病[2],高血压、糖尿病、代谢紊乱、肥胖等慢性疾病过程中心脏和肾脏常伴有组织纤维化[3]。心脏组织纤维化可导致PR间期延长、心脏传导阻滞、心房颤动、室性心律失常、左室收缩和舒张功能障碍、心力衰竭等。肾脏中肾小球纤维化会导致肾小球滤过功能下降,肾小管间质纤维化可导致肾小管重吸收功能下降,加快发展为慢性肾脏疾病[4]。然而,目前临床上缺乏针对心肾综合征发病过程中心肾组织纤维化的治疗方法和策略。白术内酯Ⅰ为白术的重要生物活性成分,其对脂多糖(LPS)诱导的动物急性肺损伤具有较好的保护作用[5];可以通过减少肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和一氧化氮(NO)的产生抑制小鼠主动脉环中慢性炎症[6];还可能通过抑制p38-MAPK 和 NF-κB信号通路的激活而抑制低密度脂蛋白导致的血管内膜平滑肌细胞的增生、分化及炎症反应[7]。Wang等[8]研究发现白术内酯Ⅰ可通过减少炎症细胞因子和内毒素来改善大鼠肾功能。炎症反应激活是组织纤维化发生的重要环节,基于白术内酯Ⅰ的上述作用,推测其可能通过抑制炎症反应来抑制心肾综合征发病过程中心脏和肾脏组织纤维化,为此本研究进行了验证,希望给心肾综合征的治疗带来一定启发和思考。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠50只,体重(200±20)g,6周龄,由南方医科大学实验动物中心提供,许可证号:SCXK (粵)2011-0015。饲养大鼠1周适应环境后再进行实验,饲养条件为恒温(20±2) ℃,湿度(50±5)%,24 h 自由摄水,人工照明各12 h。

1.2药物及主要试剂和设备 白术内酯Ⅰ晶体(成都曼思特生物科技有限公司,纯度>98%);水合氯醛、氨苄青霉素钠(Sigma-Aldrich 公司,美国);血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)试剂盒(南京建成生物工程研究所);尿蛋白定量测试盒(PanEra);大鼠脑钠肽(BNP)ELISA试剂盒(Cloud-Clone)。动物呼吸机(泰盟,型号:HX-300S),心电监护仪(邦健型号:ECG-101A),酶标仪(Thermo,型号:Varioskan LUX),体式显微镜(Leica,型号:S8APO),倒置显微镜(Leica,型号:DMI1),荧光显微镜(Leica,型号:DMI8),冷光源动物手术灯(深圳市瑞沃德生命科技,型号:76301),微量离心机(Thermo,型号:LEGEND Micro21R),电热恒温水浴锅(Blue Pard,型号:HWS26),心脏超声仪(Vevo 2100 Imaging System)。

1.3实验方法 参考文献[9]的方法,采用永久性结扎冠脉前降支联合3/4大部分肾切方法建立心肾综合征模型:先对50 只大鼠行永久性冠脉前降支结扎术,1周后行3/4大部分肾切术,肾切术后1周对存活下来的42只大鼠行心脏超声检查,剔除左心室射血分数(LVEF)>60%的5只大鼠,将剩余37只大鼠采用随机数表法随机分为模型组(10只)、白术内酯Ⅰ低剂量组(9只)、白术内酯Ⅰ中剂量组(9只)、白术内酯Ⅰ高剂量组(9只)。白术内酯Ⅰ低、中、高剂量组分别给予0.3 mg/kg、1 mg/kg、3 mg/kg白术内酯Ⅰ(现配现用,每20 mg白术内酯Ⅰ晶体溶于0.2 mL DMSO中,再用生理盐水将药物母液稀释至40 mL,得到浓度为0.5 mg/mL白术内酯Ⅰ药物溶液)腹腔注射,模型组给予5 mL/kg生理盐水腹腔注射,均1次/d,连续注射2周。

1.4标本采集 注射2周后,将各组大鼠放入代谢笼,常规饲养24 h,记录24 h总尿量和大鼠体重,将尿液常温下1 500 r/min离心5 min后,取上清尿液-80 ℃保存。采用5%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠后,将其仰卧固定,心尖取血,放入肝素化2.0 mL EP管充分混匀,4 ℃下8 000 r/min离心6 min,取上清液-80 ℃保存。心尖取血后取出肾脏和心脏,修剪去除肾脏包膜、脂肪组织和左、右心耳,生理盐水泡洗后,无菌纱布吸干心脏及肾脏表面残余水分,清除心脏和肾脏表面血迹,分别称重后-80 ℃保存。

1.5检测指标及方法

1.5.1心脏超声检查 注射2周后再次行心脏超声检查,记录LVEF、每搏量(SV)、心排血量(CO)、左心室短轴缩短率(LVFS)、左心室前壁收缩末期厚度(LVAWs)、左心室前壁舒张末期厚度(LVAWd)、左心室后壁收缩末期厚度(LVPWs)、左心室后壁舒张末期厚度(LVPWd)、左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期容积(LVESV)、左心室舒张末期容积(LVEDV),每只大鼠留取2个心动周期图像及参数,最终值取2次心动周期的平均值。

1.5.2血、尿生化指标 采用尿蛋白定量测试盒(CBB法)检测24 h尿蛋白水平,肌氨酸氧化酶法检测SCr水平,脲酶法检测BUN水平,竞争抑制酶联免疫分析法测定BNP水平,严格按照对应试剂盒说明书具体操作步骤和注意事项进行。

1.5.3心、肾质量指数 心脏质量指数=心脏质量/ 体重×100%,左心室质量指数=左心室心超校正后质量/体重×100%,左肾质量指数=左肾质量/体重×100%。

1.5.4心、肾组织病理形态和组织中转化生长因子-β1(TGF-β1)、胶原蛋白Ⅰ、平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达情况 将心脏和肾脏组织置于4%甲醛溶液中固定24 h后进行脱水、包埋、切片处理,按标准步骤进行心脏和肾脏HE染色、马松染色及免疫荧光染色。在200倍视野下随机采集心脏和肾脏HE染色切片非梗死区图像;在400倍光学显微镜下随机选取马松染色切片非梗死区10个非重复视野,用Image Pro Plus 6.0软件分析胶原面积;在400倍光学显微镜下随机选取组织免疫荧光切片非梗死区10个非重复视野,通过 Image J 软件处理后计算荧光强度。

2 结 果

2.1各组大鼠心脏超声指标比较 白术内酯Ⅰ各组大鼠CO、SV、LVEF、LVFS、LVAWs、LVAWd均明显高于模型组(P均<0.05),LVEDV、LVESV、LVPWs、LVPWd、LVESD、LVEDD与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05);白术内酯Ⅰ各组间各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1及图1。

图1 各组心肾综合征大鼠左心室短轴心脏超声图像

表1 各组心肾综合征大鼠心脏超声指标比较

2.2各组大鼠血、尿生化指标比较 白术内酯Ⅰ各组大鼠24 h尿蛋白及血SCr、BUN水平均明显低于模型组(P均<0.05),白术内酯Ⅰ各组间24 h尿蛋白及血SCr、BUN水平比较差异均无统计学意义(P均>0.05);白术内酯Ⅰ中、高剂量组大鼠血BNP水平均明显低于模型组和白术内酯Ⅰ低剂量组(P均<0.05),白术内酯Ⅰ中、高剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 各组心肾综合征大鼠24 h尿蛋白及血SCr、BUN、BNP水平比较

2.3各组大鼠心、肾质量指数比较 白术内酯Ⅰ低、中、高剂量组大鼠心脏质量指数、左心室质量指数、左肾质量指数均呈逐步降低趋势,其中白术内酯Ⅰ高剂量组大鼠心脏质量指数、左心室质量指数和白术内酯Ⅰ各组大鼠左肾质量指数均明显低于模型组(P均<0.05),白术内酯Ⅰ各组间各指标比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 各组心肾综合征大鼠心脏、肾脏及左心室质量指数比较

2.4各组大鼠心脏、肾脏组织形态学比较

2.4.1HE染色 与模型组相比,白术内酯Ⅰ各组非梗死区心肌细胞排列较整齐,细胞间质局灶性纤维化及炎症细胞浸润减少;白术内酯Ⅰ各组肾脏非梗死区肾小管结构较整齐,肾小管呈囊性扩张,肾小球增大、结构较清晰,炎症细胞浸润减少。见图2。

图2 各组心肾综合征大鼠心脏和肾脏组织HE染色表现(×200)

2.4.2马松染色 ①心肌细胞纤维呈红色,肌纤维之间填充的胶原组织呈蓝色。模型组肌纤维排列紊乱,细胞间质被大量蓝色胶原组织填充,胶原沉积明显;白术内酯Ⅰ各组大鼠心肌肌纤维排列较整齐,细胞间质胶原沉积面积均明显低于模型组(P均<0.05),且白术内酯Ⅰ中、高剂量组均明显低于白术内酯Ⅰ低剂量组(P均<0.05),白术内酯Ⅰ高剂量组明显低于白术内酯Ⅰ中剂量组(P<0.05)。②肾小管上皮细胞和部分肾小球呈红染,部分肾小球和肾间质含有胶原组织呈蓝色。模型组大鼠肾小管上皮细胞萎缩较明显,肾小管间质和大部分肾小球可见明显胶原组织填充;白术内酯Ⅰ各组大鼠肾小管萎缩有所改善,胶原面积均明显低于模型组(P均<0.05),且白术内酯Ⅰ高剂量组均明显低于白术内酯Ⅰ低、中剂量组(P均<0.05),白术内酯Ⅰ低、中剂量组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图3及图4。

图3 各组心肾综合征大鼠心脏和肾脏组织马松染色表现(×400)

图4 各组心肾综合征大鼠心脏和肾脏胶原面积比较

2.5各组大鼠心脏纤维化相关蛋白表达情况比较免疫荧光染色显示,模型组大鼠心肌组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ呈块状分布;α-SMA主要呈环状分布于血管壁,在心肌细胞间质呈斑点状分布。白术内酯Ⅰ各组大鼠心肌组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ呈点状分布,TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA表达强度均明显低于模型组(P均<0.05);白术内酯Ⅰ高剂量组TGF-β1、α-SMA表达强度均明显低于白术内酯Ⅰ低剂量组(P均<0.05),胶原蛋白Ⅰ表达强度明显低于白术内酯Ⅰ低、中剂量组(P均<0.05);白术内酯Ⅰ中剂量组α-SMA表达强度明显低于白术内酯Ⅰ低剂量组(P<0.05)。见图5及图6。

图5 各组心肾综合征大鼠心脏组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA免疫荧光染色表现(×400)

图6 各组心肾综合征大鼠心脏组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA阳性表达免疫荧光强度

2.6各组大鼠肾脏纤维化相关蛋白表达情况比较免疫荧光染色显示,TGF-β1主要表达于肾小管间质和肾小球基底膜;胶原蛋白Ⅰ主要表达于肾小管间质,呈点状分布;α-SMA主要呈环状分布于血管壁,在肾小管间质及肾小球基底膜呈斑点状分布。白术内酯Ⅰ各组大鼠肾脏组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA表达强度均明显低于模型组(P均<0.05);白术内酯Ⅰ高剂量组TGF-β1表达强度明显低于白术内酯Ⅰ低剂量组(P<0.05);白术内酯Ⅰ中、高剂量组胶原蛋白Ⅰ表达强度均明显低于白术内酯Ⅰ低剂量组(P均<0.05),且白术内酯Ⅰ高剂量组明显低于白术内酯Ⅰ中剂量组(P<0.05);白术内酯Ⅰ各组间α-SMA表达强度比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图7及图8。

图7 各组心肾综合征大鼠肾脏组织中TGF- 1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA免疫荧光染色表现(×400)

图8 各组心肾综合征大鼠肾脏组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA阳性表达免疫荧光强度

3 讨 论

心肾综合征是一组多种病因、多种状态的症候群,临床表现复杂、多样,其病理生理学机制考虑与血流动力学障碍、炎症与氧化应激、器官交互损伤有关[10]。临床上心肾综合征患者常表现为心脏收缩功能减退,射血分数降低,心搏量减少,肾小球滤过率降低,肾小管重吸收功能减退,24 h尿量减少,尿蛋白明显增加,治疗手段主要为强心、利尿、扩张血管、抑制RASS系统激活、心脏再同步化治疗、超滤和透析等[11],但很难从根本上遏制或者延缓心肾综合征病程进展。有些心肾综合征治疗策略存在矛盾,比如呋塞米等利尿剂虽然可以明显降低心脏前负荷,减少水钠潴留,但可能会导致肾功能进一步损害[12]。ACEI或ARB类药物可以抑制RASS系统激活、扩张血管,同时也存在损害肾功能和导致高钾血症的风险[13]。

近年研究发现,在缺血/再灌注SD大鼠模型中,白术内酯Ⅰ预处理可以减少心梗面积,通过抑制Caspase-3信号通路的激活来抑制心肌细胞的凋亡,同时对心肌内线粒体损伤有保护作用[14]。本研究结果发现,白术内酯Ⅰ各组大鼠SV、CO、LVEF、LVFS、LVAWs、LVAWd均明显高于模型组,白术内酯Ⅰ中、高剂量组大鼠血BNP水平和白术内酯Ⅰ各组大鼠24 h尿蛋白及血SCr、BUN水平均明显低于模型组,说明白术内酯Ⅰ可以改善心肾综合征大鼠心脏收缩功能和肾功能,抑制心室重构。组织病理学观察发现,模型组大鼠心脏和肾脏大量炎症细胞浸润,而白术内酯Ⅰ各组大鼠心脏、肾脏非梗死区组织炎症细胞浸润明显减少,表明白术内酯Ⅰ具有抗炎作用。

纤维化是组织过度修复过程,其显著特征为肌纤维母细胞增生以及细胞外基质过度沉积。研究表明,包括巨噬细胞、T淋巴细胞、成纤维细胞和肌成纤维细胞在内的间质细胞利用半乳糖凝集素-3和TGF-β1的共同信号通路,导致成纤维细胞和肌成纤维细胞增殖,其产生和分泌胶原蛋白前体,在细胞外间质中交联形成成熟的胶原蛋白,加重组织的纤维化[15]。TGF-β1参与许多病理生理过程,可调节各种组织分化和参与纤维化,其可直接诱导成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,同时在募集纤维细胞和促进肌成纤维细胞分化中发挥重要作用[16],可促进细胞外基质蛋白的生成和沉积,抑制蛋白酶合成从而减少基质降解[17]。心脏组织纤维化是心脏发生重构过程中的重要病理改变,并最终导致心脏功能下降[18]。TGF-β1/Smads 在心肌纤维化的进程中起着关键性的作用,是公认的心肌纤维化信号通路[19-20]。肾脏纤维化主要表现为肾小球硬化、肾间质纤维化及肾血管硬化[21],其中TGF-β1介导的成纤维细胞激活是肾脏纤维化的重要驱动力,TGF-β1/Smads信号通路是肾脏纤维化的关键调节者[22]。可见TGF-β1在心脏和肾脏纤维化中具有重要推动作用,通过抑制TGF-β1的表达可以减轻心肾纤维化程度。既往研究表明,白术内酯Ⅰ可通过抑制TGF-β1/Smads信号通路的激活,抑制肾脏上皮细胞和间质细胞的纤维化[23-24]。本实验结果显示,模型组大鼠心脏和肾脏梗死区大量纤维结缔组织填充,非梗死区胶原沉积明显增多,白术内酯Ⅰ各组心脏和肾脏非梗死区胶原沉积较模型组明显减少,证实白术内酯Ⅰ可以明显抑制心肾综合征大鼠心肾组织纤维化,且呈一定剂量依赖性。进一步心肾组织免疫荧光染色发现,白术内酯Ⅰ各组大鼠心脏和肾脏组织中TGF-β1、胶原蛋白Ⅰ、α-SMA荧光表达强度较模型组明显降低,表明白术内酯Ⅰ抗心肾纤维化的作用可能与抑制TGF-β1信号通路,减少心脏和肾脏组织中α-SMA、胶原蛋白Ⅰ的合成有关。

综上所述,白术内酯Ⅰ可以改善心肾综合征大鼠心脏收缩功能、肾小球滤过功能和肾小管重吸收功能,抑制心脏肥大,其可能通过抑制TGF-β1的表达以及胶原蛋白Ⅰ、α-SMA生成发挥抗心脏、肾脏组织纤维化作用。但本研究由于设备因素限制,未能测量大鼠血压,缺少衡量心肾功能的一个重要指标;另外由于时间和经费的原因,未定量分析TGF-β1、胶原蛋白I、α-SMA的表达情况。故本实验结论有待进一步证实,白术内酯Ⅰ抗心肾纤维化作用机制尚需系统研究。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。