群体基因组分析揭示短耳犬蝠适应城市化的遗传学基础

王菲 赵华斌

（武汉大学生命科学学院，武汉 430072）

随着人类社会的发展，人类活动深刻地影响了地球生态环境，成为一种足以与自然力量相匹配的影响因素 (Crutzen, 2002)。这种由人类活动主导的地质时代被称为人类世 (Anthropocene) (Dirzoet al., 2014; Vidler, 2021)。在全新世一万多年的时间内，全球平均气温一直相当稳定，但在过去短短的一百年里全球平均气温上升了1 ℃ (Glikson,2016)，说明人类活动对地球生态环境产生了巨大影响。人类世开始的时间众说纷纭，但由于人类经济活动在1945—1955 年呈指数增长，1945 年是一个得到广泛认可的时间点 (Corlett, 2015)。快速城市化是当代人类世的一个显著特征 (Munshi-Southet al., 2016)。城市化改变了自然生态系统，如农田被住宅代替、湖泊被泥土填埋以及森林被砍伐进而导致生境破碎化，还有工业废气和汽车尾气无节制排放导致热岛效应的产生等等 (Harris and Munshi-South, 2017)。这一系列破坏自然环境的行为对生物多样性和各物种的种群规模都造成一定冲击(Fahrig, 2003; Dirzoet al., 2014)；有研究发现，城市中的鸟类群落相较于农村稀有物种更少、物种丰富度更低 (Senguptaet al., 2014)。

蝙蝠是城市中最多样的哺乳动物类群之一 (Vitouseket al., 1997; Jung and Kalko, 2011)，虽然在城市中分布广泛，但其物种丰富度却随着城市化程度加深而减少 (Gaisleret al., 1998)。因此，城市化是蝙蝠面临的主要威胁之一 (Fricket al., 2020)。当生活在城市中的蝙蝠食用了接触过农药的水果或饮用受污染的水后，其免疫系统和身体机能可能会受到影响 (Bayatet al., 2014)；同时，蝙蝠的一些生活习性让其对城市化引起的栖息地扰动特别敏感，由于蝙蝠是夜行性动物，夜晚道路的人工照明加剧了道路的屏障效应，对许多飞行缓慢的蝙蝠造成了阻碍，缩小了其活动范围 (Stoneet al., 2009)；另外一些依靠回声定位捕食的蝙蝠可能由于道路上的各种交通噪声干扰其低频声波，进而影响其捕食效率 (Siemers and Schaub, 2011)(图1)。早期关于城市化对蝙蝠影响的相关研究主要集中在行为学和生态学方面，关注蝙蝠适应城市化的遗传机制研究则相对较少。短耳犬蝠(Cynopterus brachyotis) 是城市中较为常见的蝙蝠，隶属于狐蝠科 (Pteropodidae) 犬蝠属 (Cynopterus)，广泛分布在南亚、东南亚等热带地区，以水果、花蜜和多种植物花粉为食，常栖息在城市的次生林或农地的光线阴暗处，有助于传播本地植物种子、保护植物景观，在生态系统中扮演着重要角色 (Chanet al., 2021)。然而，随着城市化日益加剧，短耳犬蝠的栖息环境发生了巨大变化，这可能会对其生存产生一定影响。以发生快速城市化的新加坡为例，近期的研究表明，随着人类活动增加，1931—2012 年短耳犬蝠的遗传多样性呈明显的持续下降趋势 (Chattopadhyayet al., 2019)。然而，该研究并没有探究与城市化相关的遗传学基础。因此，本研究旨在通过分析短耳犬蝠的历史和当代群体的基因组数据，解析基因组中的选择信号，进而探究城市化对蝙蝠的影响及蝙蝠适应城市化的遗传学基础。

图1 对蝙蝠产生影响的城市化因素 (蝙蝠剪影来源于phylopic.org)Fig. 1 Urbanization factors affecting bats (Bat silhouettes were taken from phylopic.org)

1 研究方法

1.1 数据来源

本研究对象为新加坡的短耳犬蝠，使用的41个蝙蝠个体的基因组序列数据来自Chattopadhyay等 (2019) 发表的文章。全部个体均来自新加坡，无明显的群体结构 (Chattopadhyayet al., 2019)。其中21 个样本采集于1931 年，构成本研究中的历史样本数据集；另外20 个样本采集于2011—2012年，构成当代样本数据集。

1.2 数据质控、比对、突变位点的识别

先使用fastp (Chenet al., 2018) 去除原始数据中低质量的序列，再使用FastUniq (Xuet al.,2012) 去除序列中的PCR 重复。过滤后的序列与短耳 犬 蝠 的 参 考 基 因 组 (GenBank 编 号SSHV00000000) 通过 Burrows-Wheeler Aligner(BWA) 的BWA-MEN 命令进行比对，得到Sequence Alignment/Map Format (SAM) 格式文件。使用Samtools (Liet al., 2009) 中的sort 命令将SAM文件转换为二进制的BAM 文件，然后使用bcftools (Liet al., 2009) 对BAM 文件进行单核苷酸多态性分析 (SNP calling)，得到存储单核苷酸多态性信息的Variant Call Format (VCF) 格式文件。

1.3 选择信号分析

1.3.1 位点突变频率方法

单核苷酸多样性 (single nucleotide polymorphism, SNP) 通过碱基的转换、颠换、插入、缺失引起DNA 序列发生改变，这些改变可能会导致DNA 序列翻译出的氨基酸与之前不同。氨基酸发生改变的核苷酸变异为非同义突变，反之则为同义突变。基因的非同义突变可能会不同程度地影响蛋白质的结构和功能，长期以来都是进化遗传学研究的重点内容。本研究利用短耳犬蝠基因组的General Feature Format (GFF) 文件对得到的VCF文件进行注释，筛选出发生非同义替换的位点信息。分别计算历史样本数据集、当代样本数据集中非同义替换位点的突变频率 (f历史，f当代)。如果(f历史- f当代) ＞ 0.8 或 (f历史/ f当代) ＞ 2，则认为，相较于当代样本，该基因在历史样本中有显著高的突变频率；如果 (f当代- f历史) ＞ 0.8 或 (f当代/ f历史) ＞ 2，则认为，相较于历史样本，该基因在当代样本中有显著高的突变频率 (Zhanget al., 2020)。

1.3.2 基于群体遗传分化的选择信号检测方法

群体间遗传分化指数 (fixation index, Fst) 和核苷酸多样性 (π) 已被证实是评估选择信号的有效方法。Fst 越大，提示种群间的遗传差异越大；π 数值越大，说明种群内的核苷酸多样性越高 (Weir and Cockerham, 1984)。本研究将二者结合使用，将过滤后总样本数据集的VCF 文件利用vcftools(Daneceket al., 2011) 计算短耳犬蝠历史样本数据集、当代样本数据集之间的Fst 值 (滑动窗口长度为50 kb)，同时分别计算短耳犬蝠历史样本数据集、当代样本数据集的π 值 (滑动窗口长度为50 kb)。Fst 数值最高的5%和log2(π1/π2) 数值最低的5%区域的交集为历史样本受选择基因区域，Fst数值最高的5%和log2(π1/π2) 数值最高的5%区域的交集为当代样本受选择基因区域 (Qiuet al., 2015;Chenet al., 2016)。

1.3.3 基于单倍型的选择信号检测方法

群体间扩展单倍型纯合度 (cross population extended haplotype homozogysity, XP-EHH) 是常用的比较两个群体之间的选择信号检测方法。本研究使用SELSCAN 软件进行计算 (Szpiech and Hernandez, 2014)，将短耳犬蝠当代样本数据集作为目标群体，历史样本数据集作为参考群体。当位点的XP-EHH 值为正，表明在目标群体受选择，当该值为负则代表在参考群体中受选择。对得到的所有结果按XP-EHH值从高到低进行排序，取数值最高的1%区域 (且为正值) 为当代样本受选择区域，取数值最低的1%区域 (且为负值) 为历史样本受选择区域 (Sabetiet al., 2007)。

1.3.4 受选择基因座检测方法

提取41 个样本中发生非同义替换的碱基序列作为输入文件，按样本采集时间分为历史样本、当代样本两个数据集。使用Arlequin 软件 (Excoffier and Lischer, 2010) 中的“Detecting loci under selection”功能检测在历史、当代种群中受选择的基因位点。

1.4 基因功能注释和富集

利用BLASTP 程序 (Sheet al., 2011)，E 值设定为 ＜ 10-10；将短耳犬蝠的蛋白质序列和人类蛋白质数据库中的序列进行比对，注释出短耳犬蝠的基因功能。通过Metascape (https://metascape. org)(Zhouet al., 2019) 在线数据库对选择信号分析中得到的受选择基因进行富集分析，富集通路的功能分类参考了Gene Ontology (GO) (Ashburneret al., 2000)、Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Kanehisa and Goto, 2000)、Reactome数据库 (Fabregatet al., 2017)。

2 结果

2.1 受选择基因检测

在基于群体遗传分化的选择信号检测方法中，通过计算Fst、π 值在历史样本找到了16 个受选择基因，在当代样本找到了6 个受选择基因；基于单倍型的选择信号检测方法，通过计算XP-EHH值在历史样本中鉴定出85 个基因，在当代样本中鉴定出611 个基因；基于比较位点突变频率的方法，在历史和当代样本中分别发现了240个和1 053 个受选择基因；基于Arlequin检测样本基因序列受选择基因座的方法，在历史样本中检测到413 个基因，在当代样本中检测到954 个基因 (图2)。由于基于群体遗传分化的选择信号检测方法得到的基因数目较少，后续讨论均基于其余3种方法。

图2 短耳犬蝠受选择基因数量Fig. 2 Numbers of positively selected genes in Cynopterus brachyotis

2.2 短耳犬蝠历史样本受选择基因的富集结果

短耳犬蝠历史样本的基因功能富集结果中有4 条视觉相关的通路，包括眼的形态发生 (GO:0048592)、探测可见光 (GO: 0009584)、眼的发育(GO: 0043010) 和眼的视网膜发育 (GO: 0060041)；1 条嗅觉相关的通路：嗅觉感知 (GO: 0007608)。使用Arlequin方法也同样富集到了与视觉、嗅觉相关的通路：视黄醇循环 (R-HSA-2453902)、视黄醇新陈代谢 (hsa00830)、 视觉光传导 (R-HSA-2187338) 和与化学刺激检测相关的嗅觉感知 (GO:0050911) (图3)。

图3 短耳犬蝠历史样本 (1931年) 受选择基因GO、KEGG和Reactome通路富集结果 (P ＜ 0.05). 黄色表示使用频率比得到的富集通路，绿色表示使用Arlequin得到的富集通路Fig. 3 Functional enrichment analysis of GO terms, KEGG and Reactome pathways for positively selected genes in historical samples (sample from 1931) of the fruit bat (P ＜ 0.05), with yellow representing pathways identified using the frequency ratio method, and green indicating pathways identified using Arlequin

2.3 短耳犬蝠当代样本受选择基因的富集结果

对短耳犬蝠当代样本进行富集分析的结果显示，3 种方法一共发现了26 条与免疫相关的通路，包括：T 细胞的选择 (GO: 0045058)、正调控白细胞分化 (GO: 1902107)、病毒生命周期的负调控(GO: 1903901)、病毒进入宿主细胞的负调控 (GO:0046597) 等 (图4)。这些通路包含了ⅠL2RA、ⅠL10、C2、C3AR1、STAT6、GSDMA、NLRP10等重要的免疫基因。在当代样本中，还发现了味觉传导(hsa04742)、酸味感知 (GO: 0050915) 和苦味感知(GO: 0050913) 3 个与味觉相关的通路，包括ⅠTPR3、PⅠGR、TAS2R5、TAS2R4、RTP4、RTP1、SCNN1A、PKD2L1、PKD1L3、TAS1R2等基因 (图4)。其中TAS2R4和TAS2R5是Ⅱ型味觉受体基因(Tas2r) 家族成员，功能是感知苦味化合物 (Bachmano and Beauchamp, 2007)。此外，我们还发现了与听觉相关的通路耳蜗外毛细胞对声音的感知 (RHSA-9662361)。

图4 短耳犬蝠当代样本 (2011—2012年) 受选择基因GO、KEGG和Reactome通路富集结果 (P ＜ 0.05). 黄色表示使用频率比得到的富集通路，蓝色表示使用XP-EHH得到的富集通路，绿色表示使用Arlequin得到的富集通路Fig. 4 Functional enrichment analysis of GO terms, KEGG and Reactome pathways for genes in contemporary samples (sample from 2011 -2012) of the fruit bat (P ＜ 0.05), with yellow representing pathways identified using the frequency ratio method, blue representing pathways identified using XP-EHH, and green indicating pathways identified using Arlequin

3 讨论

本研究通过分析短耳犬蝠的群体基因组数据，在历史样本和当代样本中都找到了与嗅觉、视觉相关的受选择基因 (图3，图4)。与历史样本相比，在当代样本中发现了与免疫、听觉、味觉相关的受选择通路 (图4)，提示蝙蝠适应城市化可能在免疫应答、捕猎定位、感知食物方面发生了适应性的分子进化。

城市化改变了自然环境，工厂、住宅、商铺的兴建产生大量污水和垃圾对环境造成污染。有研究表明，环境污染物可能会损害生物的免疫系统，诱导机体产生免疫毒性 (Suzukiet al., 2020)。在短耳犬蝠当代样本的受选择基因富集结果中，本研究发现了较多与免疫相关的通路，其中在通路T 细胞的选择 (GO: 0045058) 中包含基因STAT6。免疫通路信号分子STAT6可以介导白细胞介素-4(ⅠL-4) 的表达，在淋巴瘤、哮喘、过敏性疾病等病理中起着重要作用 (Danielet al., 2000)；在正调控白细胞分化 (GO: 1902107) 和与炎症反应相关的伤口愈合 (GO: 0002246) 通路中，我们也发现了与白细胞介素相关的基因ⅠL2RA、ⅠL10、ⅠL1A。上述基因的突变可能使特异性疾病的易感性升高 (Danielet al., 2000)。同时，我们还发现了病毒生命周期的负调控 (GO: 1903901) 和病毒进入宿主细胞的负调控 (GO: 0046597) 两个与机体抗病毒免疫应答相关的通路。除此之外，我们也对非编码区的突变进行了选择信号分析，在富集结果中同样找到了T细胞外渗的调控 (GO: 2000407)、病毒感染途径(R-HSA-9824446)、白细胞介素-2 产生的正向调节(GO: 0032743) 等多条与免疫相关的通路。因此，本研究做出推测：城市建设过程中产生的环境污染对短耳犬蝠的免疫系统可能产生了一定的影响，使其免疫力下降；同时城市化带来的新生境可能让蝙蝠暴露于更多病原体中，更容易受到病原体的攻击。当代样本中还有一条值得关注的通路：利什曼原虫的生长和存活 (R-HSA-9664433)。利什曼原虫主要寄生在宿主的肝脏、脾脏、淋巴结等器官的巨噬细胞，是一种可以引起黑热病的寄生虫 (Hemet al., 2011)。有研究发现，建筑物是多种寄生虫产卵和发育的温床，栖息在建筑物中的蝙蝠容易携带更多寄生虫 (Pattersonet al., 2007)。另外，雌性蝙蝠在怀孕期间可能会受到一定程度的免疫抑制，它们在此过程中可能遭受严重的寄生虫感染 (Schneebergeret al., 2013; Lilleyet al.,2014)。这些原因可能会导致栖息在城市环境中的蝙蝠具有更高的感染寄生虫的风险。

蝙蝠一般通过视觉、嗅觉、味觉、回声定位等多种感觉系统协助来觅食 (Korine and Kalko,2005; Zhaoet al., 2009; Page and ter Hofstede,2021)。然而，短耳犬蝠无回声定位系统，其主要依赖视觉和嗅觉来寻找食物。视觉和嗅觉通路同时出现在短耳犬蝠历史和当代样本的富集结果中，暗示这两种感觉系统对短耳犬蝠觅食起重要作用。听觉和味觉相关的通路在本研究只出现在当代样本的富集结果中。一些蝙蝠通过倾听猎物发出的声音，例如翅膀运动、交配叫声等来进行定位和捕获 (Page and ter Hofstede, 2021)。模拟的交通噪音可以降低大鼠耳蝠 (Myotis myotis) 的摄食效率(Siemers and Schaub, 2011)。因此，我们推测在当代样本中富集的听觉相关通路基因可能与短耳犬蝠需要适应城市化带来的各种噪音污染有关。另外，味觉可以使动物感知食物中的营养物质和有害物质，对动物选择食物至关重要 (Bachmano and Beauchamp, 2007)。味觉相关的受选择基因包括TAS2R4、TAS2R5两个苦味受体基因；许多有毒有害物质都具有苦味，苦味受体基因对苦味物质的感知可以使动物避免摄入有害物质 (DeSimoneet al., 2001)。有研究表明，人类的TAS2R4可以感知苯甲地那铵 (Denatonium benzoate)、秋水仙碱(Colchicine)、苦参素 (Quassin) (Meyerhofet al.,2010)；苯甲地那铵可以作为厌恶剂添加到塑料橡胶玩具、防冻剂和家用清洁剂中防止误食，也会作为驱虫物质被添加到某些农药、杀虫剂中(Spannet al., 2000)；秋水仙碱和苦参素可以用作杀虫剂。人类活动可能使上述物质在环境中的含量增多，更易被蝙蝠摄入，进而使蝙蝠的苦味受体基因在当代样本中受到较强的选择压力。

在人类世，城市化不可避免地对蝙蝠等野生动物带来了巨大的负面影响，使它们在城市中的生存面临挑战 (Fahrig, 2003)。如何协调人类与自然环境的关系？尤其是在兼顾自身发展的同时保护生物多样性是人类可持续发展面临的重要挑战。本研究通过群体基因组数据检测了短耳犬蝠基因组中与城市化相关的选择信号，初步讨论了快速城市化给其带来的潜在风险，进而探究了蝙蝠适应城市化的遗传学基础。本研究提示，城市化可能影响蝙蝠的免疫系统，并干扰蝙蝠的听觉和味觉等感觉系统，同时蝙蝠可能产生快速的适应性分子进化以应对快速改变的城市生态环境。