帕金森病的细胞治疗

王雅倩 曹杜娟 刘晓蕾 张峻伟 王瑞鹏 闫卫红

山西医科大学第三医院（山西白求恩医院 山西医学科学院 同济山西医院），山西 太原 030032

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是世界第二大常见的神经退行性疾病，影响全球约1%的老年人。由于人口老龄化加剧，给家庭和社会带来巨大的经济负担。肌强直、运动迟缓、姿势平衡障碍和震颤是其主要症状［1-2］。炎症、氧化应激、兴奋毒性、线粒体功能障碍、蛋白质清除障碍导致黑质致密部（substantia nigra pars compacta，SNpc）A9 多巴胺能（dopaminergic，DA）神经元变性［3-7］，这些致病因素的作用机制目前尚不清楚。PD 的病理标志是路易体的积累，由SNCA基因编码的α-突触核蛋白的错误折叠组成［8-9］。α-突触核蛋白不仅与PD 的运动症状有关，也与自主神经功能障碍、睡眠障碍和神经精神症状（抑郁、精神病、幻觉）等非运动症状有关［10］。

常规治疗是长期服用左旋多巴以改善症状，但这只在疾病早期有效，随着时间的推移其有效性会降低，当左旋多巴被运到大脑的其他部位时会产生幻觉、认知障碍和运动障碍以及开-关波动等现象，影响患者的长期治疗效果［11-12］。除药物治疗外，外科手术治疗——深部脑刺激（deep brain stimulation，DBS）也可改善帕金森病患者运动与非运动症状［13-14］，但DBS 并不能彻底根治，且运用DBS 治疗受以下因素限制：较高的成本，可能有更大的并发症如手术后的抑郁和自杀，以及需要多学科和高度专业化的医护人员进行围手术期和术后管理［15-16］。开发PD新的治疗制剂成为一项挑战。由于PD 病理生理学靶点是SNpc多巴胺能神经元的退行性变性与丢失，细胞替代疗法成为一种新的治疗策略［17］。将源于供体组织或供体干细胞移植到SNpc 处可替代原有细胞产生多巴胺，逆转神经缺损症状并恢复运动功能［18］。

1 胎儿腹侧中脑（fetal ventral mesencephalon，fVM）同种异体移植物

20世纪70年代，瑞典的OLSON及其同事揭示了胎儿fVM 多巴胺能细胞存活和生长的最佳孕龄为6.5～9周，并且使用合适的组织和因子（如星形胶质细胞、成纤维细胞因子）的共移植来增强胎儿fVM的存活率［19］。20世纪80年代初的研究显示，将fVM组织制成的细胞悬液移植入PD小鼠模型中，移植物不仅存活下来且能够支配宿主纹状体、接收传入纤维、释放多巴胺并逆转运动功能缺陷［20］。1987年第一次对PD患者进行fVM组织移植，证实fVM移植细胞可在人脑中存活，并可恢复多巴胺水平，改善患者运动症状，术后10 a内使用正电子断层发射扫描在纹状体中监测到多巴胺，表明fVM 同种异体移植物对一些患者10 a 内有效［21］。因此，将胎儿fVM 同种异体移植到损伤的黑质纹状体处可释放多巴胺，具有长期治疗效果和存活率，改善帕金森病患者生活质量。

并非所有的移植都有效，这可能与供体的胎龄、数量（每侧1～7 个供体）、移植的靶部位（壳核、尾状核）等有关［22-23］。移植物在移植数年后会产生相关不良反应，如移植导致的运动功能障碍［24］，一种可能是由于移植物中较高比例的5-羟色胺能神经元导致的运动障碍，因为5-羟色胺能末梢以不受调节的方式释放多巴胺［25］；另一种可能是宿主对移植物产生了免疫排斥反应，损害了移植物的功能［26］。另外胎儿组织的获取所涉及的伦理问题，进一步阻止将该方法标准化运用于临床［27］。研究显示一种可大规模运用于临床的替代性组织—干细胞，具有自我更新和向多种细胞分化的潜能［28］。但胎儿fVM同种异体移植技术为后期干细胞治疗帕金森病提供了理论依据和技术指导，作出了巨大的贡献。

2 干细胞治疗帕金森病的研究进展

干细胞存在于胚胎和成人细胞中，是人体的非特化细胞，具有分化为不同种类的细胞和自我更新的能力。按其分化潜能分为全能干细胞和多能干细胞［29］。干细胞主要有两个来源：从胚泡的内细胞团中分离出的胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs），以及各种组织中的成体干细胞，如神经干细胞（neural stem cells，NSCs）和 间 充 质 干 细 胞（mesenchymal stem cells，MSCs），或通过重编程从成人体细胞获得的诱导多功能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）和来自化学激活的未受精卵母细胞——人类孤雌生殖干细胞（human parthenogenetice stem cells，hPSCs）［30］。这些干细胞通过诱导可衍生成多巴胺能神经元，补充损伤部位的多巴胺，支配纹状体神经元，恢复运动功能并改善非运动症状。本文简述了ESCs、PECs、iPSCs 治疗帕金森病的研究进展。

2.1 ESCs 衍生的神经祖细胞为行神经细胞再生治疗，开发了一种从人类胚胎干细胞（human embryonic stem cells，hESCs）产生神经祖细胞的方法。ESCs是从胚胎发育囊胚期的内细胞团分离获得到全能性细胞，具有很高的自我更新能力和潜在的分化能力，能够分化为任何一种体细胞［31-32］。

1981 年小鼠ESCs 的分离和建立彻底改变了生物学研究，由于干细胞具有无限自我更新和产生任何身体细胞类型的能力，引起了研究者极大的兴趣。THOMSON等［33］首次从人类胚泡中建立了hESC系，其能替代胎儿组织hESC系的建立推动细胞替代治疗进入新的时代。NEETA 等［34］将sonic hedgehog（SHH）和成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）-8介导的胚胎干细胞诱导多巴胺能神经元形成过程中与端粒酶永生化的人胚胎中脑星形胶质细胞共同培养，实现了多巴胺能神经元的高效富集，将这些多巴胺能神经元移植到6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）损伤的大鼠中，发现其能显著改善大鼠的运动功能。目前将ESCs 衍生的多巴胺能祖细胞移植入PD 患者纹状体内的实验（European clinical trial STEM-PDtrial）正在进行，此实验避免了ESCs分化成不需要的细胞类型，并且可以将其冷冻保存，实现了临床化细胞替代治疗的广泛性和实践性。KIM等［35］将人类ESCs中产生的中脑多巴胺能神经元MSKDA01，移植到PD 患者的壳核中（ClinicalTrials.gov标识符：NCT 04802733），检测到了多巴胺能神经元的存活。这些实验结果表明使用ESCs 来源的神经祖细胞（neural progenitor cells,NPCs）的可行性。

从胎儿组织中收集未分化的胚胎干细胞，进行诱导分化形成NPCs，然后将其移植到黑质致密部，分化形成多巴胺能神经元，获得大量干细胞衍生的多巴胺能神经元。ESCs 来源的细胞具有高再现性，为研究人类神经发育、细胞命运和神经疾病机制提供了新的模型并为再生医学开辟了新的策略。但因神经祖细胞移植后产生的细胞种类范围不确定且具有无限生长的致瘤性的特征，人胚胎干细胞神经化方案可能是反复无常的，需要延长体外培养时间，且需经过修饰（如使用生长因子或者模拟腹侧中脑分化多巴胺的环境）才能获得高数量的多巴胺能神经元［36］。

2.2 孤雌生殖干细胞（PSCs）人类孤雌生殖干细胞是通过抑制未受精的卵母细胞第二次减数分裂，产生只含有母体染色体的多能二倍体细胞系［37］，其是一种多能、自我更新的干细胞。2016年，澳洲开始了孤雌干细胞的Ⅰ期临床试验（ClinicalTrials.gov标识符：NCT 02452723）［38-39］。有几项开放性临床试验测试hPESCs 在PD 患者中运用（ClinicalTrials.gov 标识符：NCT 02452723，NCT 03119636），但其存在的问题是，未受精卵本身的遗传异常和hPESCs 来源的神经前体细胞能否在移植部位分化为多巴胺能神经元［40］。在使用孤雌生殖干细胞移植的试验中，移植的神经干细胞仍不成熟，因为此干细胞会产生PAX6［41］，但真正的中脑多巴胺能神经元属于PAX 6阴性腹侧中脑神经祖细胞，不会表达PAX6。因此，表达PAX6阳性的孤雌生殖干细胞在移植后不会分化成真正的中脑多巴胺能神经元。即使一些移植的神经干细胞可能分化成为多巴胺能神经元，也只能是间脑多巴胺能神经元［42-43］。

2.3 iPSCs衍生的神经祖细胞诱导多能干细胞是运用无整合方法或使用蛋白质或化学化合物等重新编程的方法将体细胞转化为胚胎干细胞［44］。这些体细胞可以是成纤维细胞、角质细胞、星形胶质细胞、人脐带血或外周血中的单核细胞、肾小管上皮细胞等，几乎任何体细胞都可以被重编程为多能干细胞，但目前最常用于重编程的细胞类型是皮肤成纤维细胞和血细胞［45-46］。2006 年YAMANAKA 等［47-48］利用四种转录因子（OCT4、SOX2、KLF4 和c-Myc）的鸡尾酒，首次将皮肤成纤维细胞重新编程为多能干细胞，为其可持续来源打开了大门。HARGUS等［49］利用重编程技术把真皮成纤维细胞诱导形成iPSC，然后将其分化为多巴能神经元移植入未进行免疫的PD 大鼠模型中，16 周后发现了大量存活的无神经变性的多巴胺能神经元，大鼠运动功能显著改善。YEFROYEV 等［50］将PD 恒河模型自体iPSC 衍生的多巴胺能神经元移植入自身大脑中，24 个月后观察到其运动功能和精神障碍的缓解。2018 年京都大学iPSC 细胞研究和应用中心招募了第一批患者进行iPSC 衍生多巴胺能祖细胞移植试验（临床试验：R 000038278），并运用了能分选多巴胺能祖细胞的方法：CORIN+法（一种多巴胺能祖神经元的标记），提高了移植过程的安全性和有效性。这项实验将于2023年完成，将首次显示PD患者使用iPSC诱导分化多巴胺能神经祖细胞移植的可行性［51］。

此方案的缺点是自体的iPSCs细胞保留着本身导致PD的遗传变异因素，且iPSCs来源的某些体细胞具有表观遗传记忆（具有向来源组织偏向分化的能力），这种能力会影响iPSCs在体外分化的潜能，不同体细胞类型重新编程形成体细胞的效率也不一样［45，53］，因此选择合适的体细胞诱导分化为iPSCs 也是一个挑战。此外移植位置和移植细胞的区域特性以及神经元的成熟阶段将决定移植细胞在受损宿主脑回路中进行功能整合的能力，影响移植后的效果［54］。细胞在培养基中培养几个月，才能产生遗传修饰的iPSCs细胞系，文献报道细胞培养时间的增加与基因组完整性的变异有关，如致癌基因的复制和其他核型异常［55］。但不可否认的是该方案为PD 患者提供了丰富的干细胞来源，为施行细胞替代疗法提供了巨大的发展潜能，避免了胚胎组织移植的伦理问题。使用自身iPSCs 分化形成多巴胺能祖细胞进行自体移植消除了组织排斥风险［8］，是细胞替代疗法治疗帕金森病最有前景的一个策略。

3 结论

DBS由于术后管理问题和高昂的费用并不是治疗PD最佳方案。胎儿中脑腹侧组织作为PD的细胞替代疗法，已具有大量证据基础，但此策略的安全性和有效性以及涉及的伦理问题阻碍了该方案进展。ESCs 衍生细胞移植虽涉及较少伦理问题，但需严格的分化方法，才能避免形成不需要的细胞类型。未受精的生殖胚胎干细胞可获取性大，实行临床标准化细胞替代治疗的可行性较前提升，但其本身所具有的遗传变异因素尚未解决。使用iPSCs 诱导分化的多巴胺能祖细胞是PD 实行细胞治疗并有广阔前景的策略。

4 未来展望

改善帕金森病患者功能需要大量容易获得且可以广泛运用的多巴胺能神经元细胞。近年来通过不同方案获得足够的多巴胺能细胞方面已经取得了显著的进展。使用细胞替代疗法治疗PD 开辟了新的可能性，但是PD 除了运动症状外还有非运动症状，这些非运动症状并不是细胞疗法的目标，在未来的疗法中也应考虑到。另外PD 的细胞替代疗法存在移植物的潜在问题。多巴胺能神经元在移植后只有3%～20%的存活率，移植后局部微环境所产生的免疫反应和神经炎症是干扰其存活的主要因素［25］。原始材料和最终结果基因测试等问题仍有待解决，如细胞核型分析、排除致瘤突变、防止神经过度生长，是否需要进行下一代基因测序分析，细胞移植后其长距离轴突生长、方向性以及神经再支配仍然是需要研究的问题［28，56］。但相信细胞移植能够有效治疗帕金森病，恢复受损的大脑结构，随着科学技术的发展，终会将细胞移植带来的不良反应降到最低。