炭药提取液对小鼠皮肤伤口愈合过程中胶原组成的影响

王俊杰,高建萍,张 扬,张贵锋,马 莉

(1.成都中医药大学 药学院,成都 611137; 2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京 100190; 3.首都医科大学 中医药学院,北京 100069)

皮肤伤口愈合是细胞与细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)相互作用的复杂过程。ECM的合成和降解是影响伤口愈合的关键因素[1],成纤维细胞是产生ECM重建真皮的主要细胞[2],胶原是ECM的主要成分,皮肤中主要包括I型和III型胶原[3]。I、III型胶原的含量及比例是伤口愈合过程中维持皮肤机械韧性和弹性的重要因素[4],伤口愈合过程中胶原的沉积及成纤维细胞过度增生是瘢痕形成的主要原因[5]。因此,研究伤口愈合过程中胶原动态变化具有重要意义。

皮肤中I型和III型胶原主要位于真皮层,成年哺乳动物皮肤中I型和III型胶原分别约占85%和15%。I型胶原属于粗大型纤维,主要保持皮肤的机械强度;III型胶原属于细小的胶原,主要起维持皮肤弹性的作用[6]。I型和III型胶原的比例及含量随伤口愈合而不断发生变化。Wang等[7]利用海藻酸钙用于糖尿病大鼠的皮肤伤口愈合,结果表明海藻酸钙通过改善糖尿病大鼠I型胶原合成和增加 I/III胶原比率促进伤口愈合过程。何泽亮[8]利用结缔组织生长因子(CTGF)用于兔耳创面,CTGF可促进兔耳皮肤创面愈合并上调I型、III型胶原的表达和I/III型胶原比例升高。

中药炭药作为中医临床应用最具特色的传统药物,被广泛应用于治疗各种出血症和创伤[9]。雷明豪[10]利用地榆的不同炮制品作用于深Ⅱ度烧伤大鼠,发现地榆炭能降低促炎因子IL-1β、IL-6释放以及促进p38磷酸化,对烧伤创面愈合作用最强。邱彦等[11]利用血余炭纳米纤维膜作用于家兔背部双侧圆形创面,发现血余炭纳米纤维膜具有较好的止血性能,能增加创面组织毛细血管数量并显著提高创面组织羟脯氨酸含量从而加速创面愈合。炭药提取液不同于传统炭药,它是由多种中药原材料经炭烧、蒸馏水浸泡过滤得到的水溶液,含有大量无机物。研究发现无机元素能有效促进伤口愈合。周来生等[12]利用无机活性元素作用于正常人皮肤上皮细胞与烫伤型糖尿病大鼠,结果表明无机活性元素对上皮细胞的增殖、分化及创面愈合有明显的促进作用。锰、铜、锌等阳离子能够通过促进成纤维细胞、角质形成细胞及整合素的表达而促进皮肤伤口愈合[13]。目前,炭药提取液在治疗皮肤伤口愈合过程中对胶原含量变化的作用鲜有报道。

因此,本研究首先体外测定两种炭药提取液对成纤维细胞的增殖效果,初步探究其愈合活性,随后将两种炭药提取液作用于小鼠皮肤伤口,测定各组创面愈合率,再利用HPLC-MS测定小鼠创面组织中总胶原以及I、III型胶原含量,确定炭药提取液对胶原含量变化的影响,以期为炭药提取液促进伤口愈合提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料与试剂

小鼠成纤维细胞(L929细胞系)(中国科学院北京细胞库);雄性BABL/C小鼠(6～7周龄)(北京维通利华实验动物技术有限公司);液体敷料1和2(武汉市帆成丰硕生物科技有限公司);多元素混合标准储备液(北京纳克公司):Na、K、Mg、Ca、Fe(质量浓度1 000 μg/mL);Mn、Cu、Zn、Mo、Cr(质量浓度10 μg/mL),CCK-8试剂盒(北京蓝博利德生物技术有限公司);羟脯氨酸(Hyp)标准品、衍生剂2,4-二硝基氟苯(DNFB)(美国Sigma公司);胰蛋白酶(序列纯)(美国Promega公司);内标肽以及小鼠I、III型胶原特征多肽标准品(湖北强耀生物科技有限公司);乙腈、甲酸(色谱纯,德国Merck公司);其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器设备

电感耦合等离子体光谱仪ICP-OES(iCAP 6300,美国 Thermo Scientific);三重四极杆质谱(Quantunm ACCESS MAX,美国 Thermo Fisher);Orbitrap高分辨质谱(Exploris 480,美国Thermo公司);真空冷冻干燥机(北京松源华兴科技发展有限公司);二氧化碳培养箱(MCO-20AIC,日本三洋电机株式会社);酶标仪(SpectraMax 190,美谷生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 无机元素分析

参考文献[14]中的方法对液体敷料1和2进行前处理,进行ICP-OES分析。电感耦合等离子体发射光谱仪工作条件:冲洗泵速50 r/min,分析泵速50 r/min,射频功率1 150 W,辅助气流量0.5 L/min,雾化器气体流量0.6 L/min,观测方式垂直观测,重复进样3次,样品冲洗时间30 s。检测波长:钙(393.366 nm),铬(283.563 nm),铜(324.754 nm),铁(259.940 nm),钾(766.490 nm),镁(279.553 nm),锰(257.610 nm),钼(202.030 nm),钠(589.592 nm),锌(213.856 nm)。

1.2.2 炭药提取液对成纤维细胞增殖活性的影响

将处于对数生长期的小鼠成纤维细胞(L929)解离,配制成浓度为1×104mL-1的细胞混悬液。将其接种到96孔板中,每孔100.0 μL,每组设置3个复孔,培养箱中37 ℃,5% CO2条件下培养24 h后,弃去原培养液,实验组分别加入不同稀释倍数的含药培养基100.0 μL,对照组加入等体积的新鲜培养基,恒温培养48 h后,每孔加入10.0 μL CCK-8,继续孵育3 h,于酶标仪450 nm下测定各孔的吸光度(OD)值。

1.2.3 小鼠创面愈合实验

动物实验在清华大学实验动物研究中心的指导下进行(伦理证明批号:17-ZLY1)。将54只小鼠随机分成3组,分别为液体敷料1组、液体敷料2组、空白对照组,用戊巴比妥钠按照50 mg/kg的剂量麻醉小鼠,使用剃刀剔除背部毛发,75%乙醇消毒,在小鼠背脊中央剪下直径为1 cm的圆形全层皮肤,术后小鼠分笼饲养。给药方式:将药物敷于伤口表面,实验组每天给药两次,每次100 μL,空白对照以等体积生理盐水代替。

1.2.4 创面愈合率

每组分别于0、3、6、9、13、17和21 d进行拍照,利用Image-Pro Plus 6.0图像处理软件分析小鼠创面面积,计算创面愈合率。愈合率计算方法见公式(1)。

(1)

其中,P:创面愈合率;Sn:第n天的伤口面积;S0:第0天的伤口面积。

1.2.5 样品前处理

拍照完成后,各组分别处死3只小鼠,平行创面剪下直径为1 cm,深达真皮层的圆形创面组织,称重。加入4.0 mL三氯甲烷和2.0 mL甲醇,于4 ℃磁力搅拌反应12 h,重复操作2次,进行脱脂。脱脂完成后,挥干有机溶剂,加入2.0 mL的0.05 mol/L的乙酸溶液,于4 ℃浸泡过夜,匀浆,冷冻干燥,称重,待用。

1.2.6 小鼠皮肤I、III型胶原特征多肽识别

精确称取未损伤皮肤的冻干样品5 mg,加入5.0 mL NH4HCO3(0.05 mol/L,pH 8.0)溶液,沸水浴30 min,冷却至室温后按照50∶1的比例加入胰蛋白酶,37 ℃酶解18 h后,沸水浴5 min,离心(10 000 r/min,10 min),进行HPLC-MS分析[15]。

采用Protein Discoverer 2.4 软件对数据进行分析,并通过Blast序列比对的方法确定小鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原特征多肽。

1.2.7 羟脯氨酸定量分析

称取1.2.5节中冻干样品4～6 mg于安瓿瓶中,加入2.0 mL浓盐酸(6 mol/L),110 ℃水解18 h后冷却至室温;加入6 mol/L NaOH,将溶液pH值调至7.0左右,定容,每个样品取200.0 μL,分别加入100.0 μL 0.05 mol/L NaHCO3、100.0 μL DNFB,于60 ℃避光衍生1 h,进行HPLC分析[16]。

1.2.8 小鼠皮肤创面组织I、III型胶原含量测定

按照1.2.5节的方法对小鼠伤口皮肤样品进行前处理,并准确称取5.0 mg样本,酶解。利用HPLC-MS方法[15],分别对小鼠I、III型特征多肽的目标离子m/z 420.68→585.25和435.40→870.27进行离子监测,对小鼠伤口皮肤样品中的I、III型胶原特征多肽含量进行分析。

1.3 统计学方法

2 结果与讨论

2.1 炭药提取液中无机元素分析

从炭药提取液中检测到的无机元素结果见表1。其中,液体敷料1和液体敷料2共同含有Na、K、Mg、Ca、Mn、Mo和Cr,液体敷料2含有微量的Cu。液体敷料1和液体敷料2均未检测出Fe、Zn。

表1 炭药提取液中无机元素的结果

2.2 炭药提取液对L929成纤维细胞增殖活性的影响

两种炭药提取液对小鼠L929细胞的增殖结果(OD值)见表2。结果显示,液体敷料1组随着稀释倍数的增加,对L929细胞的增殖活性逐渐增强,稀释500倍时,L929细胞的增殖活性最强(P<0.000 1)。液体敷料2组随着稀释倍数的增大,L929细胞的增殖活性在减小,稀释100倍时,L929细胞的增殖活性最强(P<0.001)。

表2 L929细胞增殖能力结果

在伤口愈合的增殖阶段,成纤维细胞迁移到伤口部位开始增殖,并逐渐形成肉芽组织。同时,成纤维细胞会分化成肌成纤维细胞,肌成纤维细胞将伤口边缘拉到一起,促进伤口部位的物理闭合。在伤口愈合重塑阶段,成纤维细胞合成的I、III型胶原显著增加,以填充伤口间的缝隙[2]。因此,我们在体外测定了炭药提取液对小鼠成纤维细胞的增殖活性,初步探究了炭药提取液的愈合活性。结果表明,液体敷料1和液体敷料2均能显著促进小鼠L929成纤维细胞的增殖。

2.3 炭药提取液对小鼠皮肤伤口愈合率的影响

实验观察了0～21 d液体敷料1与液体敷料2对小鼠皮肤伤口愈合的影响。图1(a)为不同炭药提取液21 d内对小鼠创面促进愈合情况。在实验周期内,各组小鼠的皮肤逐渐愈合,其中,第13天,液体敷料1与液体敷料2组的小鼠创面结痂基本脱落,空白组小鼠创面结痂未完全脱落,表明液体敷料1组和液体敷料2组对伤口的愈合效果优于空白组。为更精确地比较各组伤口愈合效果,根据公式(1)对各组创面愈合率进行计算[图1(b)]。结果表明,在0～21 d内随着愈合时间延长,各组小鼠创面愈合率逐渐增加;实验组的创面愈合率均优于空白组;在第3～9天,各组创面愈合率:液体敷料1组>液体敷料2组>空白组;第13～21天时,各组创面愈合率:液体敷料2组>液体敷料1组>空白组。

(a)各组小鼠创面愈合情况;(b)各组小鼠创面愈合率;液体敷料1、2与空白组相比,* 表示P<0.05,** 表示P<0.01。n=3。

液体敷料1由地榆、白芷、蒲黄等中药材组成;液体敷料2由仙鹤草、紫草、白芨等中药材组成。前期实验检测出液体敷料1和液体敷料2中固形物含量分别为4.18和4.85 mg/mL,同时两种炭药提取液中共同含有的金属包括Na、K、Mg、Ca、Mn、Mo和Cr,液体敷料2中单独检出Cu。研究证明K+、Ca2+、Mg2+等无机离子在皮肤伤口愈合中发挥重要作用[17-21]。实验结果初步表明,含有K+、Ca2+、Mg2+等无机离子的两种炭药提取液均能有效缩短创面愈合时间,为了进一步验证炭药提取液对伤口愈合过程的影响,试验分析了伤口愈合过程中胶原的动态变化。

2.4 伤口愈合过程中炭药提取液体对胶原的影响

2.4.1 炭药提取液对总胶原的影响

羟脯氨酸(Hyp)是胶原特有的氨基酸,在鼠皮胶原中占比约10%[22-23],本实验通过HPLC法测定不同愈合时期小鼠创面的Hyp含量,图2为样本中总胶原含量结果。结果显示,第21天,各组总胶原含量达到最大值;液体敷料1在第9、13天胶原含量大于空白组(P<0.01);液体敷料2在第9、13、21天胶原含量大于空白组(P<0.05)。

液体敷料1、2与空白组相比,* 表示P<0.05,** 表示P<0.01。n=3。

2.4.2 I、III型胶原特征肽的筛选

I型胶原和III型胶原是皮肤等结缔组织中常见的胶原蛋白,至少占所有胶原蛋白含量的95%[24],因此,我们主要检测I型和III型胶原。试验采用特征肽法分析了I、III型胶原的动态变化。

小鼠I、III型胶原中局部相同序列较多,其中,少量的差异序列可作为其特征多肽,小鼠皮肤酶解产物总离子流图见图3(a)。利用Protein Discoverer软件对图3(a)进行检索,并对小鼠Ⅰ、Ⅲ型胶原进行Blast序列比对,确定其差异性序列。小鼠皮肤中m/z 420.738的一级质谱图见图3(b),图3(b)表明m/z 420.738为双电荷离子,其分子量为839.461,与多肽GVVGPQGAR的理论分子量一致。m/z 420.738碎裂后产生的二级碎片离子(b、y离子)通过Protein Discoverer 2.4软件进行检索,图3(c)为m/z 420.738的二级质谱图,其中,蓝色标记为实际与理论匹配的y离子,红色标记为实际与理论匹配的b离子,匹配率较高。因此,小鼠皮肤酶解产物中存在多肽GVVGPQGAR。通过Blast多序列比对,多肽GVVGPQGAR只存在于小鼠的I型胶原α1链中,多肽GVVGPQGA可作为小鼠I型胶原的特征多肽,采用同样方法鉴定到小鼠III型胶原特征多肽DGNPGSDGQPGR。以上两条肽段满足序列较短、无羟基化修饰位点、二级碎片离子匹配度较高等特征多肽的条件[16],可用于小鼠皮肤I、III型胶原的定量分析。

(a)小鼠皮肤总提取离子流图;(b)鼠Ⅰ型胶原特征肽段的一级质谱图;(c)鼠Ⅰ型胶原特征肽段的二级质谱图。

2.4.3 小鼠创面组织Ⅰ、Ⅲ型胶原含量

以特征多肽浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,得到I型胶原特征肽回归曲线方程:y=0.083 974 8+0.322 485x,R2=0.993 1;III型胶原特征肽回归曲线方程:y=0.092 872 5+0.109 828x,R2=0.997 5,线性关系良好。图4(a)和图4(b)为小鼠创面组织I型胶原和III型胶原含量结果,图4(c)为胶原I/III的比值。

(a)小鼠创面组织I型胶原含量;(b)小鼠创面组织III型胶原含量;(c)小鼠I型胶原与III型胶原比例;液体敷料1、2与空白组相比,* 表示P<0.05,** 表示P<0.01,# 表示P<0.001,## 表示P<0.000 1。n=3。

各组I、III型胶原含量均随时间增加呈增长趋势;与空白组相比,液体敷料1组在第3～21天的I型胶原含量均明显大于空白组(P<0.05),液体敷料2组在第3、9和17天的I型胶原含量均明显大于空白组(P<0.01);伤口愈合的第17天,液体敷料1组与液体敷料2组的I型胶原含量达到最大值,分别是(0.623±0.046) mg/mg、(0.604±0.021) mg/mg。

与空白组相比,液体敷料1与液体敷料2组在第3、6、9天的III型胶原含量明显大于空白组(P<0.01),而在伤口愈合的第13、17和21天,液体敷料1和液体敷料2组的III型胶原含量无明显差异。伤口愈合的第21天,液体敷料1与液体敷料2组III型胶原含量达到最大值,分别为(0.116±0.007) mg/mg与(0.112±0.002) mg/mg。

胶原作为细胞外基质的主要成分,为器官提供机械稳定性、弹性和强度[25]。I型和III型胶原是结缔组织的主要胶原类型,在伤口愈合方面发挥着重要作用。I型胶原由两条α1链和一条α2链组成的异源三聚体,它提供了原纤维基质的高拉伸强度和刚性。III型胶原是一种含有3个α1链的同源三聚体,通常与I型胶原密切结合,形成富含I型胶原的杂化原纤维,以增加组织的柔韧性和扩张性[6,25]。在创面愈合早期,Ⅲ型胶原对创面的愈合发挥着重要作用,肉芽组织及早期瘢痕富含Ⅲ型胶原[5],Broughton等[26]认为,在创面愈合过程的后期,Ⅲ型胶原被重吸收,逐渐被Ⅰ型胶原替代,从而提高伤口的拉伸强度。实验结果证明,液体敷料1与液体敷料2在创面愈合早期能增加III型胶原的表达从而加快肉芽组织的形成,在创面愈合21 d内,增加I型胶原的表达,提高组织的机械韧性,加速创面愈合。

皮肤中Ⅰ型和Ⅲ型胶原的含量和比例随年龄和损伤程度不同而不同[27]。Birk等[28]认为胶原I/III的比例调节了新生纤维的直径,决定了肉芽组织的结构,而胶原I/III比例的增加可以增强创面组织结构的稳定性。与III型胶原相比,I型胶原占比越高表明胶原越成熟[29]。图4(c)显示,空白组胶原I/III的比值随着愈合天数增加呈下降趋势,液体敷料1与液体敷料2组胶原I/III的比值随着愈合天数的增加不断上升,且在第17天和第21天,液体敷料1与液体敷料2组I/III的比值明显大于空白组(P<0.01),表明两组炭药提取液能通过增加胶原I/III的比值,增强皮肤组织强度,加速伤口愈合。

3 结论

本研究表明两种炭药提取液能促进成纤维细胞的增殖同时加快创面闭合时间;在伤口愈合前期,两种炭药提取液通过增加III型胶原的表达从而促进肉芽组织的形成;通过增加总胶原含量以及刺激I型胶原的表达,增加I型胶原与III型胶原的比例,从而增强创面组织的机械强度,促进伤口愈合。本研究为炭药提取液促进伤口愈合提供了理论依据。