人工授粉对大别山五针松结实率及种子特性的影响

项小燕,童跃伟,潘 扬,汪黎明,吴甘霖

(安庆师范大学 生命科学学院 皖西南生物多样性研究与生态保护安徽省重点实验室,安庆 246133)

物种濒危是多因素共同作用的结果,其中,花粉不足或无效授粉是导致种群结实率低、种子质量不高的重要因素[1]。人工授粉是解决这一关键问题的重要手段,加上操作方便,目前已广泛应用于经济作物的结实率、植物的繁育系统及传粉互作等科学问题的研究[2]。

大别山五针松(PinusdabeshanensisW.C.Cheng &Y.W.Law)属松科松属,现为国家一级保护植物。其野生种群仅在安徽省岳西县大王沟相对集中分布,约200余株,且多为中老龄个体,林下幼苗少见,种群呈衰退趋势[3]。花粉为雄配子体,其活力对授粉、种子质量和子代适合度等方面均具有直接影响[4]。项小燕等[5]对大别山五针松花粉活力研究表明,个体花粉平均活力在95%以上,另外,在室温下,大别山五针松花粉活力7 d内没有明显降低,可用于人工授粉。种子产量,通常以总种子数和有活力的种子数来表示,是衡量植物早期适合度的重要指标[6]。Xiang 等[7]对野生种群大别山五针松球果结实率及种子萌发特性研究显示,大别山五针松球果的败育率较高,是物种濒危的重要原因。因而,本研究以我国特有濒危植物大别山五针松为研究对象,通过人工控制授粉,研究大别山五针松栽培种群在不同授粉处理下的结实率及种子特性,旨在为进一步采取可能的保护和种群复壮措施提供生殖生物学理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验地概况

由于自然种群个体多分布在悬崖附近,且个体较高,人工授粉困难。因而,实验样地设在安徽省岳西县大王沟林场内。该地地处116° 06′51″ E,30°49′12.2″ N,海拔780 m,属北亚热带温暖湿润季风气候区。年平均气温为14～15 ℃,极端低温-14.2 ℃,无霜期212 d。雨量充沛,年降水量1 350～1 400 mm。土壤为山地棕壤,pH值为5～5.5。1978年从野生种群移苗种植,面积约为1公顷,共有32株成年植株散生,这些成年植株均能形成雌雄球花,实验于2015年3月至2016年9月间进行。

1.2 物候观察

从2015年3月初开始观察大别山五针松花芽的萌动情况。起初一周观察一次,待到4月中旬芽鳞脱落后每3天观察一次,适时掌握大别山五针松花芽的发育情况。

1.3 研究方法

(1)个体选择。在前期物候观察的基础上,2015年4月底,共选择10株生长良好、花芽数量较多的个体,每株选择32个生长发育良好的雌球花,并在散粉前对24个雌球花进行套袋处理,分别进行不同标记,设套袋不授粉、套袋授同株粉和套袋授异株粉3组;另8朵只标记不套袋,作为自然传粉对照组。

(2)花粉活力测定。为进一步确保授粉前花粉的质量,在密切观察大别山五针松传粉滴出现的基础上,于人工授粉当天采集所选择的10株个体花粉进行混合,连续3 d,参考文献[5]方法检测花粉的活力。

(3)人工授粉。本实验在盛粉期的9:30—11:00期间开展,共进行3 d。花粉活力测定后,分别采集实验组同株花粉和异株花粉,其中,异株花粉选择5株不同个体的新鲜花粉混合,小心去除套袋,分别用不同毛笔将相应花粉授予雌球花,再套上袋子,并于第3天补授一次。待整个居群花粉飞散完毕,摘去袋子,并观察球果的生长情况。

(4)结实率统计。2016年9月,分植株采集成熟球果,并以球果为单位,放尼龙袋中做好标记,统计每一植株各处置组的球果数,并用精确度为0.01 mm的游标卡尺测量球果的长和宽。自然风干后,分离种子,每一球果随机挑选10粒外形正常的种子,用上述方法测量种子长、宽、厚等指标,并通过水选法筛选出下沉种子即为饱满种子,统计饱满种子数与空种子数,计算每个球果各类型种子数量的平均值。

(5)种子活力测定。参照国际种子检验协会(International Seed Testing Association,ISTA)种子检验规程,用0.1%红四啖唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)测定不同处理组饱满种子的活力,每组10粒种子,设3个平行对照,具体方法参考文献[8]。

1.4 数据统计分析

种子活力百分数=(染色种子数/实验种子总数)×100%;结实率=(球果数/总处理数)×100%。数据用SPSS 19.0对结实率、球果特性及种子特性进行方差分析,并用Turkey进行组与组之间的比较。

2 结果与分析

2.1 花粉活力

花粉是子代个体的父本来源,其活力直接影响植物授粉、受精、种子产量和质量。因而,在人工授粉之前检测花粉活力对子代的形成具有重要意义。

图1显示,连续3 d授粉,当天测定的大别山五针松新鲜花粉活力均在96%以上,因而可以保证花粉的质量。

相同字母表示无显著性差异(P>0.05)。

2.2 不同授粉处理对球果结实率的影响

高等植物为适应种群生存,其交配系统通常比较复杂,有的以自花授粉为主,有的以异交为主,也有混合交配等情况。因而授粉方式通常对结实率产生重要影响,进而关联种子及幼苗的形成等。

大别山五针松人工授粉对球果结实率的影响见图2。从图2可见,套袋不授粉处理下,大别山五针松的结实率最低,仅为17.5%,与其他3组差异显著。套袋授异株粉后球果的结实率最高,所有球果均能正常生长,结实率为100.0%,其次是自然授粉组,为97.5%;套袋授同株粉的结实率尽管为80.0%,但与另两组之间无统计学差异。

1:套袋不授粉;2:套袋授同株粉;3:套袋授异株粉;4:自然授粉。不同字母表示显著差异(P<0.05)。

2.3 不同授粉处理对球果及种子性状的影响

对大别山五针松不同处理组球果及种子等各指标进行方差分析表明(表1),除了球果长外,其他指标在各组间均存在显著性差异(P<0.001)。

表1 大别山五针松4个处理组间表型性状的方差分析

对不同处理组大别山五针松球果及种子各指标的均值进行Turkey多重比较发现(表2),球果长在各组之间无显著差异,而套袋授异株粉后大别山五针松球果的宽度最大,为5.4 cm,其次是自然授粉组,为4.88 cm,两组无统计学差异,但显著高于套袋授同株粉组的球果宽度(4.08 cm),套袋不授粉组球果的宽度最小(3.26 cm),与其他3组均存在显著性差异。球果结实率方面,套袋授异株粉组的结实率最高,单个球果饱满种子数为50.0粒,同其他组相比,差异显著;其次是自然授粉组,单个球果平均饱满数为30.9粒;同株授粉可形成少量的饱满种子,单个球果平均饱满种子数为3.2粒;在套袋不授粉的情况下,大别山五针松球果不能形成正常形态的种子,饱满种子和空种子均为0,因而未能测出种子长、宽、厚等指标,其他3组种子的长、宽、厚没有显著差异。

表2 大别山五针松4个处理组间表型性状的平均值及其多重比较(Turkey,a=0.05)

2.4 饱满种子的活力

种子是遗传信息的保存者与传递者,其活力的大小对物种的繁衍生存起着至关重要的作用。活力强的种子在萌发的时候通常对环境的要求也较低,对濒危物种种群的更新尤为重要。图3显示除套袋不授粉组外其他3组饱满种子的活力,尽管不同处理形成的饱满种子数有差异,但饱满种子的活力均高达100%,显示了较高的活力。

1:套袋授同株粉;2:套袋授异株粉;3:自然授粉。相同字母表示无显著性差异(P>0.05)。

3 讨论与结论

物种成功授粉离不开较强活力的花粉。正常天气下,盛粉期测得大别山五针松花粉的活力较高,表明大别山五针松雄配子体可正常发育,能满足人工授粉需要。因而,花粉质量不是致危原因。自然情况下,倘若散粉期受到雨季的影响,易造成花粉活力下降及花粉密度降低,使雌球花受粉不足,影响子代的形成。可采取人工收集花粉进行低温储藏,进行人工补授的方式提高种群生殖力[5]。

种子是物种生存和繁衍的重要繁殖器官,其质量的优劣是影响种群未来命运的关键因子[9],而有效的结实率是形成种子的前提。作者前期野外观察发现,大别山五针松自然种群形成的种子存在3种类型:一种是只有种翅而不能正常发育的种子;一种是形态正常但内部中空的种子;另一种则为饱满种子,但种子的饱满率通常不超过50%。对松类植物来说,未授粉的胚胎通常发育成仅有种翅的败育种子,形态正常但内部中空的种子常因近交衰退导致,饱满的种子可由自交或异交形成[10-12],本研究与上述研究结果相似。研究表明,异交更有利于物种的生存和繁衍,是物种进化的重要保障。作为松属中的一员,大别山五针松在自交和异交状态下均能形成饱满的种子,而人工授异株粉后单个球果有效种子平均数为50.0粒,显著高于同株授粉组的平均数(3.2粒),表明异株授粉能有效促进球果形成高质量的种子。自然授粉情况下,大别山五针松的结实率和饱满种子均介于同株和异株授粉之间,说明在自然状态下,大别山五针松种群存在混交现象,这同Xiang 等[13]对大别山五针松遗传多样性的研究结果一致。和松类其他物种相比,大别山五针松遗传多样性属于中等水平,而花粉流是风媒传粉植物基因流的重要来源。大别山五针松花粉的传播规律表明,如果不是在强风情况下,距花粉源越近花粉密度则越高[14]。自然种群中,大别山五针松种群球果中中空种子的比例较高,说明植株接受到更多的是同株花粉或距离较近的亲缘个体的花粉。而大多套袋不授粉的球果在授粉后不久就出现落果现象,结实率仅为17.5%,极少数留存下来的球果形成的也是只有种翅发育而形态异常的种子,说明花粉的缺失会严重影响该物种子代的形成。

自交由于增加了种群内纯合体的比例,导致种群内有害基因的积累,进而产生近交衰退。近交衰退会导致种群的遗传多样性下降及子代的适合度降低[15]。子代适合度主要包括种群结实率、种子的数量和质量以及种子的萌发和后代的生长情况等[16]。从生殖保障上来说,当物种处于不良环境时,自交是保存物种的一种重要方式[17-18]。小种群由于生境片段化易导致自交衰退,从而使种子的产量降低。自然种群中大别山五针松种子中空率较高,有效种子较少[7],推测自然种群自交现象严重,此推测也得到了本研究同株授粉组的结果证实,单个球果平均饱满种子数不到4.0粒。这也是为什么大别山五针松自然种群中成年个体较多,幼龄级个体较少,种群呈衰退趋势的重要原因[3]。异株授粉组也存在部分形态正常、内部中空的种子,这可能是由于实验对象皆为移栽个体,所采集的花粉来源集中,部分个体与实验组之间的亲缘关系较近。

本研究通过人工控制授粉研究了大别山五针松在不同处理下球果的结实率及种子特性等指标。实验表明,花粉的有无及花粉的来源对大别山五针松的生殖力具有重要影响。人工套袋授异株粉无论是球果的结实率还是单个球果饱满种子数均最高,能有效提高大别山五针松种群的生殖力;自然授粉的结实率虽然和异株授粉组无显著差异,但在近交衰退的影响下,单个球果的平均饱满种子数显著比异株授粉组少;而在没有花粉来源的情况下,大别山五针松的结实率最低,且无法形成正常种子。无论通过哪种授粉方式,最终形成的饱满种子的活力均为100%,体现了有限资源的有效性。因而,在今后的保护工作中,可以对操作方便的人工林辅以人工授异株粉,进而提高种子的产量和品质,通过人工播种育苗从而达到扩大种群、保护濒危物种的目的,对精细规模的基因流水平,尤其是花粉流的贡献,有待进一步开展父系分析研究。