C@TiCoO3@TiO2纳米材料制备及在可见光下的抗菌性

周 游,章少琪,李昀霏,李 松,甄德帅,陈丽丽

(南华大学 衡阳医学院 公共卫生学院,衡阳 421001)

由于大部分过渡金属离子如Cu、Ni、Co、Cr等的氧化还原电位位于TiO2禁带宽度范围内,因此,可以改变电子迁移路径,减少电子从VB跃迁到CB所需的能量,产生更多有效的e-/h+对,并延长e-/h+对的寿命,增大吸收光的范围,以此提高TiO2的光催化性能[17-18]。然而,仅仅掺杂单一过渡金属离子对提高TiO2光催化性能非常有限,尤其是过量掺杂金属阳离子会产生新的电子-空穴复合中心,促进e-/h+对的复合,反而会降低TiO2的光催化性能。因此,研究多组分元素,例如金属与非金属,对TiO2性能改善的协同效应,进一步提高TiO2的光催化效率和对可见光的利用率逐渐成为人们研究的重点[19-21]。

本文通过溶胶-凝胶法将过渡金属Co掺入TiO2纳米材料,并利用制备过程中的高温条件,使有机物碳化,产生C,最终合成纳米复合材料C@TiCoO3@TiO2。利用扫描电子显微镜(Scanning electron microscope,SEM)、X射线衍射光谱(X-ray diffraction spectroscopy,XRD)、X射线光电子能谱(X-ray photoelectron spectroscopy,XPS)和紫外-可见漫反射测试(UV-Vis diffuse reflection spectroscopy,UV-Vis DRS)对该复合材料进行表征分析,并对其光催化性能、灭菌效果和体外细胞毒性进行评价。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

钛酸四丁酯,分析纯,购自上海市阿拉丁试剂有限公司。无水乙醇、乙酸(HAc),分析纯,购自上海国药集团化学试剂有限公司。硝酸钴,分析纯,购自北京市通广精细化工公司。LB肉汤培养基(胰蛋白胨10.0 g;酵母抽提物5.0 g;NaCl 10.0 g)购自生工生物工程(上海)有限公司。LB琼脂平板(LB肉汤培养基;15 g/L琼脂粉)、琼脂粉购自北京索莱宝科技有限公司。Cell Counting Kit-8试剂购自奥默生物技术(上海)有限公司。Dulbecco’s Modified EagleMedium(DMEM)购自美国Hyclone公司。Gibico胎牛血清购自美国Gibico Life Technologies公司。

1.1.2 仪器

Rigaku SmartLab SE型X射线衍射光谱仪(XRD),日本Rigaku公司;Scientific K-Alpha型X射线光电子能谱仪(XPS),美国Thermo公司;TESCAN MIRA LMS型扫描电子显微镜(SEM),美国Tescan公司;UV-3600i Plus型紫外可见近红外漫反射波谱仪,日本津岛公司;iMark型酶标仪,美国Bio-Rad公司;HR1500-ⅡA2型生物安全柜,青岛海尔生物医疗股份有限公司;TDB-9型LED灯,深圳市我的照明灯饰有限公司。

1.2 方法

1.2.1 C@TiCoO3@TiO2制备

用溶胶-凝胶法合成C@TiCoO3@TiO2。将10 mL钛酸四丁酯加入30 mL乙醇中混匀,得到淡黄、透明的A液;将Co(NO3)2∶H2O∶HAc按2.72∶2∶8的体积比搅拌混匀后得到B液[22-23];以6 s/滴的滴速将B液加入A液中,边滴边搅拌,滴加完毕后在40 ℃下连续搅拌过夜,充分反应后得到溶胶混合物。经2 d的陈化完全形成凝胶,放入100 ℃的烤箱中干燥过夜得到固体凝胶,再经500 ℃煅烧1 h后研磨成粉末,合成Co与Ti摩尔比为1.3%(Co/Ti=1∶0.013)[23]的纳米复合光催化剂。

1.2.2 细菌培养及浓度测定

将细菌接种到LB液体培养基中,在37 ℃,200 r/min振荡培养过夜后,取菌液在5 000 r/min下离心5 min,弃去上清液,用0.9%无菌生理盐水离心洗涤3次后重悬。紫外分光光度计测600 nm处的OD值估计细菌浓度,并用无菌生理盐水将细菌悬液调整到合适浓度。

1.2.3 C@TiCoO3@TiO2的光催化杀菌特性

本实验用经典革兰氏阴性菌(大肠埃希菌)、革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)评价C@TiCoO3@TiO2的杀菌活性。每个抗菌实验都在无菌环境中进行。将5 mg/mL的C@TiCoO3@TiO2分别加入装有1 mL的2×106CFU/mL大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液的EP管中,在功率为7 W的LED白光灯,距离20 cm下照射。分别照射不同的时间(0、20、40、60、80和100 min)后,取100 μL稀释到103CFU/mL,再取100 μL涂布于LB平板上,37 ℃培养18 h,计数菌落数,并以黑暗条件下加C@TiCoO3@TiO2和单纯光照射不加C@TiCoO3@TiO2作为对照组。称一定量的C@TiCoO3@TiO2与生理盐水混合制成10 mg/mL母液,然后进行梯度稀释使材料的质量浓度分别为10、5、2.5和1.25 mg/mL;取2×106CFU/mL细菌悬液和等体积生理盐水或不同浓度材料(10、5、2.5和1.25 mg/mL)混匀,用LED灯照射100 min后,取100 μL稀释到103CFU/mL,再取100 μL涂布于LB平板上,37 ℃培养18 h,计数菌落数,并以未经处理的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌菌悬液作为对照。

1.2.4 C@TiCoO3@TiO2的细胞毒性试验

用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒测定材料对Hela细胞的细胞毒性作用。提前一天将细胞接种于96孔板中,每孔细胞密度约为5×104mL-1。用DMEM稀释不同质量浓度(10、5、2.5和1.25 mg/mL)的C@TiCoO3@TiO2,超声1 h后加入细胞培养板,各组孔板对应反应条件分别为空白对照组(细胞+培养基)、光照组(细胞+培养基+光照)、含有不同质量浓度的C@TiCoO3@TiO2组(细胞+培养基+C@TiCoO3@TiO2)、C@TiCoO3@TiO2+光照组(细胞+培养基+光照+C@TiCoO3@TiO2),37 ℃、5% CO2孵育24 h。用PBS洗涤2遍,每孔加入10 μL CCK-8试剂,继续培养1 h后用酶标仪测量各孔在450 nm处的OD值,计算细胞活力。

2 结果与讨论

2.1 C@TiCoO3@TiO2光催化原理

图1 C@TiCoO3@TiO2光催化杀菌机理

2.2 C@TiCoO3@TiO2表征

2.2.1 SEM分析

用SEM观察C@TiCoO3@TiO2的形貌,X射线能谱仪(EDS)分析其元素组成及含量。由图2(a)可知,材料呈片状、比表面积较大,利于细菌大量吸附。EDS的元素含量图[图2(b)]和元素映射图[图2(c)～(f)]显示,材料由O、Ti、C、Co 4种元素组成,元素质量分数(wt%)分别为48.43%、41.7%、9.78%和0.09%,说明Co成功均匀掺杂在TiO2中,并且在制备过程中有机物碳化产生了C。由于Co元素含量很少,且可能分布在材料内部,所以Co元素的EDS元素映射图谱并不明显。

(a)C@TiCoO3@TiO2的电镜形貌图;(b)EDS元素分布图谱;(c)～(f)元素映射图谱。

2.2.2 XRD分析

C@TiCoO3@TiO2的XRD图谱显示,在2θ值为25.26°、37.80°、48.22°、54.40°、55.06°、62.56°、68.86°、70.26°、75.16°和82.88°处的衍射峰,与典型的四方晶系锐钛矿型TiO2的标准卡片(JCPDS卡片编号71-1168)的一系列衍射峰大致吻合(图3),说明所制备的C@TiCoO3@TiO2仍以锐钛矿晶型形式存在。锐钛矿作为光催化领域研究最多的晶型,其晶粒的比表面积较大,且其表面有更多的空位和缺陷,具有较高的光催化活性[26]。另外,还检测到TiCoO3的特征衍射峰(JCPDS卡片编号83-2243),说明Co元素掺杂成功。但未检测到C元素的特征衍射峰,可能是因为在掺杂过程中高温使有机物碳化,产生的C主要以无定型的形式存在,因此检测不到。

图3 C@TiCoO3@TiO2的XRD图谱

2.2.3 XPS分析

X射线光电子能谱(XPS)进一步分析所制备样品的元素组成和化学状态。如图4所示,出现明显的Ti 2p、C 1s和O 1s信号峰,说明材料中含Ti、C、O元素。但能谱上无明显Co元素特征峰,可能是由于掺杂的Co元素很少,因此在778 eV附近未检测到Co元素存在,与SEM结果一致。

图4 C@TiCoO3@TiO2的XPS图谱

2.2.4 UV-Vis DRS测试

用UV-Vis DRS测试C@TiCoO3@TiO2的可见光吸收能力并计算其带隙。如图5所示,C@TiCoO3@TiO2在紫外和可见光区域展示出宽吸收,吸收边界约762 nm。相比于纯TiO2的吸收范围更大(≤390 nm)。C@TiCoO3@TiO2的价带和导带之间的区域为禁带宽度,根据Tauc曲线公式:

图5 C@TiCoO3@TiO2的紫外-可见漫反射光谱

(αhν)n=K(hν-Eg)

计算得到C@TiCoO3@TiO2半导体的禁带宽度Eg约1.63 eV(图6),其中α为吸收系数,h为普朗克常数,ν为频率,K为常数。相比纯的锐钛矿型TiO2(3.2 eV)[22],C@TiCoO3@TiO2的禁带宽度明显减小,以此增加光子能量的吸收,对可见光有更好的响应能力。

图6 C@TiCoO3@TiO2的Tauc’s plots 曲线

2.3 C@TiCoO3@TiO2体外抗菌性能测定

(a)C@TiCoO3@TiO2不同质量浓度下大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的琼脂平板;(b)C@TiCoO3@TiO2作用不同时间大肠埃希菌的存活率;(c)C@TiCoO3@TiO2作用不同时间金黄色葡萄球菌的存活率。

进一步比较C@TiCoO3@TiO2分别在黑暗或光照条件下对大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果。图7(b)和(c)显示,大肠埃希菌和C@TiCoO3@TiO2共培养100 min,黑暗条件下,存活率为61.78%,光照条件下,存活率为0,说明C@TiCoO3@TiO2在黑暗和光照条件下对大肠埃希菌均有杀菌作用,但光照条件下杀菌效果更好;而金黄色葡萄球菌和C@TiCoO3@TiO2在黑暗条件下,共培养100 min可完全被杀死;而在光照条件下,仅需共培养60 min。结果表明,C@TiCoO3@TiO2本身对细菌有一定的杀伤作用,光催化作用下,可以增强其杀菌效果,C@TiCoO3@TiO2对金黄色葡萄球菌的抗菌性能高于大肠埃希菌。大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌在LED灯照射下C@TiCoO3@TiO2的杀菌效率(金黄色葡萄球菌光照60 min,大肠埃希菌光照100 min,抑菌率99.9%)优于单纯二氧化钛粉剂(光照24 h,大肠埃希菌抑菌率为86.06%,金黄色葡萄球菌抑菌率为94.04%)[27]。

2.4 C@TiCoO3@TiO2的细胞毒性试验

CCK-8法检测材料的细胞毒性,即生物相容性。材料质量浓度在5 mg/mL的范围内,细胞活力基本在80%以上。但是当材料质量浓度为10 mg/mL时,与对照组相比有明显的细胞毒性(图8)。结果说明,该材料在5 mg/mL的质量浓度范围内对细胞的毒性较低,生物相容性好。

图8 C@TiCoO3@TiO2对Hela细胞的细胞毒性

3 结论

通过溶胶-凝胶法成功制备了一种C@TiCoO3@TiO2可见光抗菌纳米材料。5 mg/mL的C@TiCoO3@TiO2在LED可见光灯照射下60、100 min内分别可以杀灭99%以上的大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌,其抑菌效果优于单纯的纳米TiO2溶液(10 g/L,日光灯照射24 h),且对细胞没有明显的细胞毒性。良好的杀菌性能可能是由于Co的成功掺杂及有机物的碳化,使该材料表明电子-空穴寿命延长、对可见光的吸收增强,并增加了和细菌的接触面积。