TRIM59,EIF5A2在非小细胞肺癌组织中的表达及对转移分化的预估价值

王玉文 周雅琪 宋宗义 赵云龙

非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在肺癌中占比高达80%以上,有生长慢、转移扩散晚的特点[1]。近年来,NSCLC五年生存率仍无重大突破,从分子生物学方向寻找高特异性、高敏感度的标志物用于NSCLC早期诊断、预后监测,已成为医学界研究热点[2]。前期经第二代测序技术发现三结构域蛋白59(tripartite motif-59,TRIM59)和真核翻译起始因子5A2(eukaryotic translation initiation factor 5A2,EIF5A2)等在癌组织中表达升高,对NSCLC转移分化有促进作用。Shen等[3]报道TRIM59是一种癌基因,在胆管癌发生和增殖等过程中发挥重要作用。EIF5A2为癌细胞增殖过程中的上游调控因子之一,可促进肿瘤发生发展[4]。但关于TRIM59、EIF5A2在NSCLC中表达水平是否能作为患者肿瘤转移分化的预估标志物,相关报道鲜见,故开展本次实验。

1 材料与方法

1.1 病例材料

选取2018年1月至2019年1月经我院病理确诊的NSCLC组织与正常肺组织标本各80例,同时收集相应患者完整的临床资料。本研究经我院伦理委员会批准。

1.2 实验方法

1.2.1 qRT-PCR法检测NSCLC组织与正常组织中TRIM59、EIF5A2 mRNA表达 将组织样本液氮研磨,提取RNA,反转录为cDNA,用qRT-PCR试剂盒(日本TAakara公司)进行PCR实验。20 μL反应体系:cDNA 2 μL,上下游引物各2 μL,无酶水3.6 μL,ROX 0.4 μL,SYBR®Premix Ex TaqTM10 μL。反应步骤:预变性95 ℃ 6 min,变性95 ℃ 30 s,退火65 ℃ 35 s,延伸72 ℃ 20 s,共40个循环。每个样本设置重复3次,以GAPDH为内参基因,计算TRIM59、EIF5A2 mRNA相对表达量,用2-△△Ct公式计算。TRIM59引物:上游5′-TTGATCTCGTGGTTTGGGGG-3′,下游5′-ACTGTGTTGGTGTTTGTGGC-3′;EIF5A2引物:上游5′-TGGGCCCGTTATTTCTGCAT-3′,下游5′-CAGGTTCTGTTACCCCGCAT-3′;GAPDH引物:上游5′-GCAACTAGGATGGTGTGGCT-3′,下游5′-TCCCATTCCCCAGCTCTCATA-3′。

1.2.2 免疫组化法检测NSCLC组织与正常组织中TRIM59、EIF5A2 蛋白表达 将组织用10%甲醛固定,石蜡包埋,制作4 μm厚的切片,脱蜡至水,浸于乙二胺四乙酸溶液中,微波抗原修复10 min,冷却至室温,水洗,PBS浸洗,滴加山羊血清封闭液,室温封闭18 min,甩去多余液体,加入鼠抗人TRIM59、EIF5A2一抗(ABcam),4 ℃过夜,PBS清晰,滴加SP 900通用型生物素标记二抗(Thermo Fisher Scientific),37 ℃下孵育1 h。二氨基联苯胺显色,苏木精复染,脱水,透明,封片。对照设置为正常小鼠血清取代一抗进行替代对照,用PBS作空白对照。染色阳性结果判断:TRIM59、EIF5A2在细胞膜或细胞质内出现弥漫性分布的棕色、棕黄色颗粒即阳性细胞,按半定量积分法根据染色强度、阳性细胞所占比例计分:染色强度分为未着色、浅着色、重度着色、深度着色,依次评分为0、1、2、3分;阳性细胞百分率:高倍镜(×400)下随机选取5个视野,每个视野计数100个细胞,计算肿瘤细胞平均阳性百分率,阳性细胞数分为≤5%、>5%～25%、>25%～49%、≥50%,依次评分为0、1、2、3分。两项评分相加,0～1分、2分、3～4分、5～6分依次为(-)、(+)、(++)、(+++),(-)表示阴性,(+)～(+++)表示阳性。将两项计分相乘,≤3分为低表达,>3分为高表达。

1.3 随访及研究方法

经门诊复查和电话随访,获得患者预后情况,随访时间为3年,期间无脱落病例。根据患者是否出现转移分化分为转移分化组、未转移分化组,收集患者性别、年龄、肿瘤直径、分化程度、肿瘤位置、临床分期、浸润程度、淋巴结转移等情况,比较组间差异,并选取有统计学差异的参数进行多因素logistic回归分析;绘制受试者工作特征曲线(Receiver Operating Characteristic,ROC)及曲线下面积(Area Under Curve,AUC),分析TRIM59、EIF5A2 蛋白表达水平对肺癌患者转移分化的预估价值。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NSCLC组织与正常组织中TRIM59、EIF5A2 mRNA表达水平

NSCLC组织中TRIM59、EIF5A2 mRNA表达水平高于正常组织,比较差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

表1 NSCLC组织与正常组织中TRIM59、EIF5A2 mRNA表达水平

2.2 NSCLC组织与正常组织中TRIM59、EIF5A2 蛋白表达水平

NSCLC组织中TRIM59、EIF5A2蛋白高表达率高于正常组织,比较差异有统计学意义(P<0.05),见表2。

表2 NSCLC组织与正常组织中TRIM59、EIF5A2 蛋白表达水平(例,%)

2.3 转移分化组与未转移分化组患者临床资料比较

80例肺癌患者经随访发现,转移分化15例。

转移分化组与未转移分化组患者之间的TRIM59、EIF5A2蛋白表达情况、肿瘤分化程度差异有统计学意义(P<0.05),性别、年龄、临床分期、淋巴结转移以及肿瘤直径等差异无统计学意义(P>0.05),见表3。

表3 转移分化组与未转移分化组患者临床资料比较/例

2.4 多因素Logistic回归分析

以TRIM59、EIF5A2蛋白表达情况和肿瘤分化程度为自变量,以患者是否发生肿瘤转移分化为因变量(发生=1,未发生=0),进行多因素logistic回归分析,结果提示TRIM59、EIF5A2蛋白高表达和肿瘤低分化为NSCLC肿瘤转移分化的危险因素。见表4。

表4 NSCLC患者发生转移分化的影响因素的多因素Logistic回归分析

2.5 TRIM59、EIF5A2 蛋白表达水平对肺癌患者转移分化的预估价值

NSCLC组织中TRIM59联合EIF5A2 蛋白表达水平预估肿瘤转移分化的AUC及特异度均明显高于单独检测,而敏感度与TRIM59单独检测无差异。详见表5、图1。

图1 TRIM59、EIF5A2 蛋白表达水平对肺癌组患者转移分化的预估价值

表5 TRIM59、EIF5A2 蛋白表达水平与肺癌组患者肿瘤转移分化的预估价值

3 讨论

NSCLC的发生发展机制尚不明确,主要采取手术、化疗以及放疗等控制肿瘤迁移分化,但上述传统疗法效果欠佳,患者往往因转移分化等原因死亡[5]。因此,分析肿瘤转移分化的分子机制,探索其潜在治疗靶点十分关键,对改善NSCLC疗效有重要意义。

TRIM家族蛋白为E3泛素连接酶重要成员,已被证明其在肿瘤发生发展中参与了细胞信号传导、调控肿瘤相关分子表达等作用,这为研究TRIM家族蛋白在NSCLC中的作用机制提供了科学依据[6]。TRIM59蛋白是TRIM59基因编码的蛋白质,有RING结构域、E3泛素连接酶活性,在多个病理生理过程中扮演了角色[7]。Tong等[8]报道TRIM59基因扩增在卵巢癌组织中普遍存在,且其扩增与较差的总体生存率显著相关。Liu等[9]表明TRIM59对食管癌进展有促进作用。EIF5A2是参与多种细胞转录、翻译和核质互换等过程的蛋白,在胆囊癌[10]、前列腺癌[11]等多种人类肿瘤中表达异常升高。在本研究中,经qRT-PCR检验发现,NISCLC组织中TRIM59、EIF5A2 mRNA表达水平明显高于正常组织;免疫组织化学染色观察样本切片TRIM59蛋白主要表达于肿瘤细胞的细胞质,EIF5A2蛋白表达于肿瘤细胞的细胞质与细胞核,二者蛋白均呈高表达状态,提示TRIM59、EIF5A2在NSCLC组织中表现为异常高表达。Yang等[12]报道EIF5A2过表达可能导致癌症进展,并证明EIF5A2可能是FIGOⅠ～Ⅱ期宫颈癌的一种新的潜在预后标志物。Liu等[13]表明TRIM59过表达与不良预后相关,Guo等[14]报道通过荟萃分析评估TRIM59与肺癌预后的关系,发现TRIM59有预测肺癌患者预后的生物标志物的潜在价值。

了解TRIM59、EIF5A2在NSCLC组织中表达谱后,本研究进一步探索其对预后评估的作用。由于肿瘤转移分化是患者治疗失败、死亡的主要原因,因此将NSCLC组织对应患者按是否发生转移分化进行分组,并比较2组患者临床资料,结果显示:转移分化组患者中TRIM59、EIF5A2蛋白高表达者和肿瘤低分化者占比高于未转移分化组。将TRIM59、EIF5A2蛋白表达以及肿瘤分化作为自变量,代入logistic回归模型分析发现TRIM59、EIF5A2蛋白高表达及肿瘤低分化是NSCLC患者发生转移分化的危险因素,初步确立了TRIM59、EIF5A2蛋白表达水平在NSCLC转移分化发生过程中的作用。关于肿瘤低分化是影响NSCLC预后的独立危险因素这一点已有相关研究证明[15]。Lou等[16]认为TRIM59作为预测NSCLC患者预后的新型分子生物标志物,He等[17]报道EIF5A2 的过表达是Ⅰ期非小细胞肺癌患者生存的不良预后标志物,上述研究表明NSCLC组织中TRIM59、EIF5A2表达水平可能作为用于评估患者预后的标志物,本研究结果与上述研究存在一致性。因本研究进行单因素与多因素Logistic回归分析时纳入因素相对较少,样本量较小,分析结果可能存在误差,因而该结论有必要进行进一步证实。ROC曲线分析发现,NSCLC组织中TRIM59、EIF5A2蛋白表达情况对肿瘤转移分化有一定预估价值,二者联合用于评估转移分化的AUC以及敏感度、特异度高于单独检测,这一点可为临床评估NSCLC患者预后提供指导。

综上所述,NSCLC组织中TRIM59、EIF5A2表达水平异常升高,是NSCLC发生转移分化的危险因素,可作为患者预后评估的重要标志物。但二者具体价值仍需将来纳入更多可能的影响因素和扩大样本量进行验证。