淫羊藿苷通过Wnt/β-catenin信号通路对人前列腺癌PC3细胞增殖和凋亡的影响

李 磊 武海波 邢伟只

前列腺癌是临床常见男性泌尿系统恶性肿瘤,多发于65岁以上中老年人群,可伴发骨髓压抑症、副肿瘤综合征,并骨瘤转移至全身各处,引发循环系统衰竭,危及患者生命安全[1]。近年来,我国新增前列腺癌发病人数已居亚洲首位,且随着老龄化社会的到来及膳食模式的改变,其发病率增高明显[2]。临床治疗早期前列腺癌通常采用外科切除手术及根治性放疗术,治疗效果良好,但对于晚期及转移患者来说,仅能激素疗法及化疗,在激素抵抗、化疗耐药及高副作用的影响下,治疗效果并不理想[3]。淫羊藿苷是从中药淫羊藿中提取的中药单体,具有抗炎、抗病毒、增加血流量、调节免疫、提升骨代谢等多种生物学效应[4]。有研究表明[5],淫羊藿苷可通过调节肿瘤免疫抑制微环境,有效地触发细胞凋亡并抑制乳腺癌细胞迁移,对女性泌尿生殖肿瘤表现出良好的抑制作用。然而,目前关于其对男性前列腺癌细胞的生物学影响及相应机制研究尚少。本研究采用淫羊藿苷干预人前列腺癌PC3细胞,观察其对该细胞增殖、凋亡的影响,并探讨相关机制。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人前列腺癌PC3细胞系,购自中国科学院上海细胞库。

1.2 药物、主要试剂、仪器

淫羊藿苷(纯度:98%,上海易恩化学技术有限公司),Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路激动剂SB216763(上海百舜生物科技有限公司),细胞凋亡检测试剂盒、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)试剂盒[爱必信(上海)生物科技有限公司],兔抗人糖原合成酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)、β-catenin一抗(英国Abcam公司)。

Synergy-HT酶标仪(美国伯腾仪器有限公司),FACSCanto流式细胞仪(美国BD公司)。

1.3 细胞培养

取PC3细胞系恒温37 ℃解冻,置于培养箱内标准条件(37 ℃,5% CO2)下,经RPMI-1640培养基(含有10%胎牛血清、100 U/ml 青霉素及100 mg/L 链霉素)培养,待细胞融合至贴壁,胰酶消化传代,选取对数生长期细胞用于后续实验。每个实验设置5个复孔,取均值。

1.4 MTT法测定PC3细胞增殖活性

取对数期PC3细胞,胰酶消化重悬,调整细胞密度为1×105个/mL接种至6孔板,待细胞融合至贴壁,每孔分别加入终浓度(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)淫羊藿苷DMSO溶液,48 h后加入新鲜制备MTT溶液20 μL,作用2 h吸弃上清,再加入DMSO 150 μL,振荡15 min后静置,酶标仪检测490 nm处各孔吸光度值,计算各浓度细胞抑制率(%)=(1-各浓度孔吸光度值/对照细胞吸光度值)×100%,绘制折线图得出半抑制浓度(median inhibition concentration,IC50)。

1.5 干预与分组[6]

取对数期PC3细胞,胰酶消化重悬,待其融合至贴壁,随机分为对照组、淫羊藿苷组、激动剂组、联合组,对照组在RPMI-1640培养基中常规培养,淫羊藿苷组培养基中加入淫羊藿苷DMSO溶液(终浓度100 μmol/L),激动剂组培养基中加入SB216763 DMSO溶液(终浓度20 μmol/L),联合组加入淫羊藿苷DMSO溶液(终浓度100 μmol/L)、SB216763 DMSO溶液(终浓度20 μmol/L)。各组设置5个复孔,干预48 h进行后续实验。

1.6 MTT法检测各组增殖能力

取干预48 h后的各组细胞,胰酶消化重悬,调整细胞密度为1×106个/mL接种至96孔板,加入RPMI-1640培养液常规培养,培养24、48、72 h 3个不同时刻分别加入新鲜制备MTT溶液20 μL,作用2 h吸弃上清,再加入DMSO 150 μL,振荡15 min后静置,酶标仪检测490 nm处各组各时刻吸光度值。

1.7 流式细胞术检测各组凋亡率

取干预48 h后的各组细胞,胰酶消化重悬,调整细胞密度为1×106个/mL接种至6孔板,加入RPMI-1640培养液常规培养48 h,PBS洗涤,低温离心8 min(3 000 r/min,r=10 cm),binding buffer液标记细胞,加入AnnexinV-FITC 5 μL染色,再加入PI 5 μL二次染色,避光染色20 min,流式细胞仪检测细胞凋亡情况,并计算各组凋亡率。

1.8 检测细胞上清液VEGF水平

收集各组细胞上清液,经ELISA法检测细胞上清液VEGF水平,根据试剂盒说明书设计实验步骤,酶标仪检测波长450 nm处吸光度值,绘出曲线计算VEGF浓度。

1.9 免疫印迹法检测细胞GSK-3β、β-catenin蛋白表达

取干预48 h后的各组细胞,PBS洗涤,RIPA液裂解细胞,移至离心管内,低温离心15 min(10 000 r/min,r=12 cm),吸弃上清,经BCA法定量蛋白。取40 μg待测样本与4倍体积SDS-PAGE缓冲液混合,沸水浴加热变性,离心取上清,行上样电泳分离,湿转至PVDF膜,BSA液封闭2 h,加入兔抗人GSK-3β、β-catenin一抗(1∶500),4 ℃冷藏过夜,TBST清洗,加入二抗(1∶2 000)常温孵育2 h,TBST清洗,加入电化学发光试剂发光,暗室显影,成像分析仪分析各条蛋白条带灰度值,以GSK-3β、β-catenin蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值之比代表细胞GSK-3β、β-catenin相对蛋白表达量。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 各浓度淫羊藿苷对细胞的增殖抑制率及IC50

经终浓度(6.25、12.5、25、50、100、200 μmol/L)淫羊藿苷干预后,PC3细胞增殖抑制率逐渐升高,IC50位于50～100 μmol/L之间,后续实验均采用100 μmol/L作为淫羊藿苷干预剂量。见图1。

图1 各浓度淫羊藿苷对细胞的增殖抑制率

2.2 各组细胞增殖能力

与对照组比较,淫羊藿苷组24、48、72 h吸光度值降低(P<0.05),激动剂组24、48、72 h吸光度值升高(P<0.05);与淫羊藿苷组比较,联合组24、48、72 h吸光度值升高(P<0.05);与激动剂组比较,联合组24、48、72 h吸光度值降低(P<0.05)。见表1。

表1 各组细胞MTT吸光度值比较

2.3 各组细胞凋亡率

与对照组比较,淫羊藿苷组凋亡率升高,激动剂组凋亡率降低(P<0.05);与淫羊藿苷组比较,联合组凋亡率降低(P<0.05);与激动剂组比较,联合组凋亡率升高(P<0.05)。见表2,图2。

表2 各组细胞凋亡率比较

图2 细胞凋亡流式图

2.4 各组细胞上清液VEGF水平

与对照组比较,淫羊藿苷组上清液VEGF水平降低,激动剂组上清液VEGF水平升高(P<0.05);与淫羊藿苷组比较,联合组上清液VEGF水平升高(P<0.05);与激动剂组比较,联合组上清液VEGF水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组各组细胞上清液VEGF水平比较

2.5 各组细胞GSK-3β、β-catenin蛋白表达

与对照组比较,淫羊藿苷组GSK-3β蛋白表达升高,β-catenin蛋白表达降低(P<0.05),激动剂组GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin蛋白表达升高(P<0.05)。与淫羊藿苷组比较,联合组GSK-3β蛋白表达降低,β-catenin蛋白表达升高(P<0.05);与激动剂组比较,联合组GSK-3β蛋白表达升高,β-catenin蛋白表达降低(P<0.05)。见表4,图3。

表4 各组细胞GSK-3β、β-catenin蛋白表达比较

图3 各组细胞GSK-3β、β-catenin蛋白表达

3 讨论

前列腺癌是起源自前列腺上皮细胞的一种生殖器官癌症,早期无症状,逐渐表现为骨骼疼痛、进行性贫血、肾功能衰竭、呼吸衰竭等重度并发症[7]。该病发病隐匿、进展缓慢,多数患者确诊时已发生转移,失去根治机会,高增殖性及低凋亡性是导致前列腺癌细胞转移的主要原因[8]。因此,探寻抑制前列腺癌细胞增殖并促进其凋亡的新药物,是治疗该病的关键。中医将前列腺癌归于“癥积”、“淋证”、“血尿”等症范畴,治疗应以温阳补肾、祛湿解毒为主[9]。中药淫羊藿是临床常用补益中药,可补助肾阳而小便自利,温通气血、消化凝结,通行经络,祛除寒湿痹[10]。以淫羊藿为原料提取的中药单体对前列腺癌的治疗作用也逐渐受到关注。

VEGF是重要的肿瘤血管生长促进因子,在肿瘤自体生长及间质血管生成过程中发挥重要作用,其水平升高可增强瘤体新陈代谢、提升营养供给,从而促进癌细胞增殖,高水平VEGF亦会增加血管通透性,增强癌细胞侵袭及转移能力[11]。淫羊藿苷是一种天然植物类黄酮,可增强巨噬细胞非特异性杀伤作用及T细胞对癌细胞的毒作用,从而提升细胞免疫功能,抑制肿瘤生长[12]。Li等[13]研究认为,淫羊藿苷可抑制宫颈癌SiHa细胞活力及瘤体组织生长,增强体内抗肿瘤体液免疫,促进癌细胞凋亡,提示淫羊藿苷或可成为实体肿瘤补充治疗药物。本研究结果显示,与对照组比较,淫羊藿苷组24、48、72 h吸光度值降低,上清液VEGF水平降低,凋亡率升高,提示淫羊藿苷可抑制前列腺癌细胞增殖及血管新生,促进其凋亡。

Wnt/β-catenin信号通路是一条保守的癌基因通路,在肿瘤细胞增殖、凋亡及调控上皮间质转化等过程中扮演重要角色,其中GSK-3β、β-catenin是该通路重要组成蛋白[14]。β-catenin是一种细胞结构蛋白,在正常细胞内可与E钙粘蛋白结合,发挥细胞黏附作用,GSK-3β是Wnt信号通路调控酶,作为β-catenin拮抗蛋白起负向调控作用,在癌细胞内Wnt信号增强,其在细胞膜上与相应跨膜蛋白结合,抑制GSK-3β活性,使β-catenin磷酸化降解减少,未降解β-catenin移至细胞核,促使Wnt/β-catenin通路异常激活,参与下游促癌靶基因转录,从而促进前列腺癌细胞增殖及上皮间质转化[15]。Zou等[16]研究认为,抑制Wnt/β-catenin通路活性可显著抑制CRC细胞迁移及增殖,并促进细胞凋亡,从而抑制结直肠癌裸鼠肿瘤生长和肺转移。本研究结果显示,与对照组比较,淫羊藿苷组GSK-3β蛋白表达升高,β-catenin蛋白表达降低,且在淫羊藿苷基础上增用Wnt/β-catenin通路激动剂SB216763可减弱淫羊藿苷对前列腺癌的治疗作用,提示淫羊藿苷可能通过抑制该通路对前列腺癌细胞的增殖和凋亡产生调控作用。

综上所述,淫羊藿苷可抑制前列腺癌细胞增殖及血管新生,促进其凋亡,其作用机制可能与抑制Wnt/β-catenin信号通路活性有关。本研究仍然存在一定不足,例如前列腺癌细胞系有多种,本研究在实验条件的限制下仅选用一种细胞系,可能存在实验证据不足的问题。此外,本文研究结果仅初步提示了淫羊藿苷可通过Wnt/β-catenin信号通路调控人前列腺癌细胞的增殖和凋亡,后续需进一步验证。