苦参素对肝癌耐药细胞株HepG2/ADM的作用及机制研究

王昭辉 王国兴 郭东雅

肝癌是全球第二大恶性肿瘤,其发生率和致死率仅次于肺癌,放化疗是临床上治疗肝癌的常用手段,但长期使用化疗药物会导致患者出现耐药性,因此大大降低了临床疗效[1]。传统中药因多靶点、低毒性的优点受到学者广泛关注,苦参素又名氧化苦参碱,是从中药苦参中提取分离得到的一种生物碱,具有广泛抗肿瘤活性。研究发现,苦参素可增强化疗药物抗肿瘤效果,提高肝癌荷瘤小鼠免疫功能[2]。苦参素可抑制肝癌HepG2细胞上皮间质转化,降低癌细胞增殖、迁移和侵袭能力[3]。丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)信号通路激活与多种恶性肿瘤的进展有关,过表达miR-429可通过抑制ERK/MAPK信号通路降低肝癌HepG2细胞增殖、迁移和侵袭[4]。白芥子穴位贴敷通过阻碍ERK1/2激活可抑制肝癌H22移植瘤生长[5]。基于以上苦参素和ERK/MAPK信号通路在肝癌中的相关研究,本研究主要探讨苦参素是否能通过抑制ERK/MAPK信号通路逆转肝癌细胞化疗药物耐药性。

1 材料与方法

1.1 细胞系

人肝癌细胞株HepG2和人肝癌耐药细胞株HepG2/ADM均购自美国ATCC公司。

1.2 试剂和仪器

苦参素购自宝鸡市万晟生物开发有限公司;培养基和胎牛血清购自美国Sigma公司;细胞凋亡检测试剂盒和MTT试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;阿霉素购自深圳万乐药业有限公司;p-ERK1/2、P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)、乳腺癌耐药蛋白(breast cancer drug resistance protein,BCRP)和肺耐药蛋白(pulmonary resistance protein,LRP)抗体购自美国Abcam公司;倒置显微镜购自日本奥林巴斯公司;多功能酶标仪和凝胶成像仪购自美国Bio-Rad公司;流式细胞仪购自美国Becton Dickinson公司。

1.3 细胞培养

含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HepG2细胞。含0.5 nmol/mL浓度 ADM的DMEM培养基培养HepG2/ADM细胞,维持细胞的耐药性,实验前一周改用不含ADM的培养基培养。将细胞置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中培养,每天更换一次培养基,每2天传代1次,取第3代对数生长期细胞用于实验。

1.4 苦参素对HepG2/ADM细胞存活率的影响

胰蛋白酶消化细胞,制成密度为1×104个/mL的单细胞悬液,接种于96孔板,每孔200 μL,置于培养箱中培养。细胞贴壁生长后,随机分为空白组(只加入完全培养基,不接种细胞),不同浓度苦参素组(5 、10、20、40和60 μg/mL)以及对照组(接种细胞,不加入苦参素),培养24 h后,每孔加入5 mg/mL MTT溶液15 μL,培养箱中继续培养4 h,每孔加入二甲基亚砜150 μL,37 ℃摇床上孵育震荡10 min,置于酶标仪上测定492 nm波长处吸光度(A)值,计算细胞存活率率(%)=(实验组A值-空白组A值)/(对照组A值-空白组A值)×100%。

1.5 HepG2/ADM细胞耐药性检测

取第3代对数生长期HepG2细胞和HepG2/ADM细胞,不同浓度阿霉素(1.5、3、6、12和24 μg/mL)处理24 h,根据1.4的方法测定吸光度(A)值,计算细胞抑制率(%)=[(对照组A值-实验组A值)/(对照组A值-空白组A值)],计算阿霉素半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)。耐药指数(resistance index,RI)=耐药细胞IC50/亲本细胞IC50。为检测苦参素对HepG2/ADM细胞耐药性的逆转作用,采用10 μg/mL苦参素+不同浓度(1.5、3、6、12和24 μg/mL)阿霉素处理HepG2/ADM细胞,计算苦参素逆转倍数=耐药细胞IC50/苦参素干预后耐药细胞IC50。

1.6 Transwell实验检测细胞迁移和侵袭能力

将HepG2/ADM细胞随机分为对照组、苦参素组、阿霉素组、苦参素+阿霉素组,苦参素组细胞用10 μg/mL苦参素处理,阿霉素组细胞用15 μg/mL阿霉素处理,苦参素+阿霉素组细胞用10 μg/mL 苦参素和15 μg/mL阿霉素处理,对照组不用任何药物处理,培养24 h后,收集细胞。在铺满基质胶的Transwell上室中加入200 μL含5000个细胞的细胞悬液,下室中加入500 μL含10%胎牛血清的培养基,培养箱中培养24 h后,多聚甲醛固定10 min,1%结晶紫染色10 min,预冷PBS清洗3次,显微镜下拍照并计数。检测细胞迁移能力时Transwell小室上室中不加入基质胶,其余操作同上。

1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡率

按照1.6的方法处理细胞,24 h后,收集细胞,加入500 μL结合缓冲液将细胞重悬,再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶,充分混匀,避光孵育20 min,上样,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.8 蛋白印迹法检测细胞中蛋白相对表达量

按照1.6的方法处理细胞,24 h后,裂解液裂解,离心收集上清液,按照BCA试剂盒说明书测定蛋白样品浓度。12%聚丙烯酰胺凝胶电泳,每个上样孔加入蛋白样品50 μg,电泳结束后,将蛋白湿转至PVDF膜上,室温封闭,GAPDH、p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP抗体(1∶1000)4 ℃孵育过夜,二抗(1∶5000)室温孵育1 h,ECL法显色,Image J分析条带灰度值,目的蛋白相对表达量=目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

1.9 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度苦参素对细胞存活率的影响

细胞存活率随苦参素浓度的升高逐渐降低(P<0.05)。为满足后续实验所需细胞量,本实验选用细胞存活率接近80%的苦参素浓度10 μg/mL进行后续实验,见表1。

表1 不同浓度苦参素对细胞存活率的影响

2.2 耐药细胞的耐药性及苦参素逆转倍数

阿霉素作用于HepG2细胞和HepG2/ADM细胞后,两种细胞的IC50分别是(4.04±0.63)μg/mL、(19.27±1.69)μg/mL,耐药指数为4.77。阿霉素单独处理HepG2/ADM细胞和苦参素联合阿霉素处理HepG2/ADM细胞的IC50分别为(18.66±0.84)μg/mL、(7.25±0.37)μg/mL,苦参素逆转倍数为2.57。

2.3 细胞迁移能力检测结果

与对照组比较,苦参素组和阿霉素组迁移细胞数减少(P<0.05);与苦参素组和阿霉素组比较,苦参素+阿霉素组迁移细胞数均减少(P<0.05),见表2,图1。

图1 结晶紫染色检测迁移细胞数(×200)

表2 各组细胞迁移能力比较

2.4 细胞侵袭能力检测结果

与对照组比较,苦参素组和阿霉素组侵袭细胞数减少(P<0.05);与苦参素组和阿霉素组比较,苦参素+阿霉素组侵袭细胞数均减少(P<0.05)。见表3,图2。

图2 结晶紫染色检测侵袭细胞数(×200)

表3 各组细胞侵袭能力比较

2.5 细胞凋亡率检测结果

与对照组比较,苦参素组和阿霉素组细胞凋亡率升高(P<0.05);与苦参素组和阿霉素组比较,苦参素+阿霉素组细胞凋亡率升高(P<0.05)。见表4,图3。

图3 流式细胞仪检测细胞凋亡

表4 各组细胞凋亡率比较

2.6 蛋白印迹法检测结果

与对照组比较,苦参素组p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP蛋白相对表达量降低(P<0.05);与阿霉素组比较,苦参素+阿霉素组p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP蛋白相对表达量均降低(P<0.05)。对照组和阿霉素组各蛋白相对表达量比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表5,图4。

图4 细胞中各蛋白表达Western blot图

表5 各组细胞中p-ERK1/2、P-gp、LRP和BCRP蛋白相对表达量比较

3 讨论

肿瘤多药耐药性(MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药性的同时,对其他结构不同、作用靶点不同的药物也产生耐药性的现象,MDR是恶性肿瘤治疗失败的重要原因之一[6],严重制约患者的化疗效果和预后,因此探讨肿瘤耐药的具体机制、寻找新的治疗策略对逆转肝癌多药耐药性具有重要意义。

多项研究表明,苦参素具有逆转恶性肿瘤耐药性的作用。Liang等[7]研究表明苦参素通过抑制结肠癌细胞上皮间质转化和NF-κB信号转导逆转5-氟尿嘧啶耐药性。苦参素通过降低程序性细胞死亡1蛋白表达可逆转非小细胞肺癌对顺铂的耐药性[8]。由此可见,苦参素对化疗耐药的肝癌细胞具有一定的作用。本研究通过MTT法检测不同浓度苦参素对HepG2/ADM细胞的影响,结果显示:细胞存活率随苦参素浓度的升高而降低。可见,苦参素对HepG2/ADM细胞的增殖具有一定抑制作用。阿霉素是临床上常用的化疗药物,本研究用不同浓度阿霉素处理亲本细胞HepG2和耐药细胞HepG2/ADM,发现HepG2/ADM细胞出现明显耐药性。通过苦参素联合不同浓度阿霉素处理HepG2/ADM细胞发现,苦参素明显逆转细胞耐药性。此外,通过检测细胞迁移和侵袭能力以及细胞凋亡率,我们发现,单独使用苦参素或阿霉素可升高细胞凋亡率,降低细胞迁移和侵袭能力,而联合使用苦参素和阿霉素作用效果更为显著。以上结果表明:苦参素不仅具有抑制HepG2/ADM细胞增殖的作用,而且可逆转HepG2/ADM细胞对阿霉素的耐药性。

MAPK是一组信号通路,其中包括ERK信号通路、p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)以及c-Jun NH2末端激酶(JNK),在细胞增殖分化和生长中起着重要调节作用。MAPK/ERK信号通路不仅能促进加速细胞周期所需基因的积累,而且可调节抑制细胞增殖的基因表达,因此该信号通路与多种恶性肿瘤的发生发展密切相关。Ding等[9]研究发现下调H19可能通过阻断MAPK/ERK信号通路诱导肝癌细胞氧化应激并逆转CD133阳性肿瘤干细胞化疗耐药。Ke等[10]研究表明敲除砷抗性蛋白2通过抑制MAPK/ERK通路可降低人胶质母细胞瘤细胞增殖活性。长链非编码RNA0006528通过激活MAPK/ERK信号通路促进人乳腺癌进展[11]。本研究蛋白印迹法显示:阿霉素和苦参素均可降低p-ERK1/2表达,且两者联合作用效果更显著。

P-gp是多药耐药基因编码产物,主要存在于细胞膜上,其能够将进入肿瘤细胞的化疗药物主动泵出,减少肿瘤细胞内的化疗药物,从而使细胞产生耐药性。BCRP是一种新型的ABC转运蛋白,同样具有将化疗药物泵出肿瘤细胞的作用。LRP是一种跨膜转运糖蛋白,它不仅可以阻止某些以细胞核为效应点的药物通过核膜孔进入细胞核,而且可以将进入细胞质的药物转运至运输囊泡中,从而隔绝药物发挥作用[12-13]。人肝癌细胞HepG2/ADM中LRP和BCRP表达升高,美洲大蠊提取物可降低LRP和BCRP表达,逆转耐药细胞的耐药性[14]。本研究中苦参素可降低HepG2/ADM中LRP、P-pg以及BCRP蛋白表达,说明苦参素可逆转HepG2/ADM细胞耐药性。

综上所述,苦参素对肝癌耐药HepG2/ADM细胞的耐药性具有一定逆转作用,而且可降低耐药细胞迁移和侵袭能力,诱导细胞凋亡,其可能是通过抑制ERK/MAPK信号通路发挥作用。为临床治疗肝癌提供理论依据。