基于GEO数据库和网络药理学探讨鸡血藤-络石藤治疗强直性脊柱炎的作用机制

许鑫杰,李志岭,张曼怡,王弋戈,张剑勇

(1.广州中医药大学第四临床医学院,广东深圳 518033;2.深圳市中医院,广东深圳 518033)

强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis, AS)是一种慢性免疫性炎症疾病,其以慢性腰背疼痛、晨僵、外周关节炎为主要临床表现,严重者脊柱强直;发病年龄以20～30岁青壮年为主,目前AS的发病机制尚不明确,涉及遗传、环境和免疫等因素。西医治疗AS以非甾体抗炎药物、改善病情的抗风湿药及生物制剂等为主,并不能延缓AS影像学的进展[1],长期治疗往往出现肝肾功能异常、胃肠道及心血管事件等毒副作用。而祖国医学治疗AS疗效确切,能够控制关节炎症,延缓病情发展,减少骨质破坏[2,3]。

藤类中药在风湿免疫疾病中广泛应用,经查阅文献,药对“络石藤-鸡血藤”为多数医家治疗AS的常用配伍[4-5]。现代研究表明,鸡血藤有抗炎、镇痛、抗氧化及抗血栓形成等治疗作用[6],络石藤提取物有抗炎镇痛效果[7]。临床研究表明,以鸡血藤、络石藤为主要成分的方剂有良好的疗效[8,9],提示该药对可能在治疗AS中发挥了重要作用。故本研究根据网络药理学及分子对接技术,探讨“鸡血藤-络石藤”药物活性成分、潜在靶点以及作用机制,为“鸡血藤-络石藤”药对治疗AS提供一定的理论支持。

1 资料与方法

1.1 络石藤-鸡血藤药对有效活性成分和靶点筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform,TCMSP)中,分别输入关键词“鸡血藤”、“络石藤”,以口服利用度(oral bioavailability,OB)≥30%和类药性(drug likeness,DL)≥0.18为筛选标准获取有效成分及靶点,经Unitprot数据库对基因进行标准化处理。

1.2 AS疾病靶点检索

利用Gene Expression Omnibus(GEO)数据库,以“ankylosing spondylitis”为关键词,获取GSE25101的芯片数据集,此数据集包含32个样本,AS患者与健康人群各16例。使用R软件4.2.2对数据进行处理,以|logFC| >0.5,P<0.05为筛选条件获取差异基因,并绘制火山图。登录DisGeNET(https://www.disgenet.org/)、GeneCards(https://www.genecards.org/)、DrugBank(https://go.drugbank.com/),以“ankylosing spondylitis”为检索词获取AS相关基因。整合所有数据库并去除重复基因,最终获取AS基因集。

1.3 药对-有效成分-靶点网络图

将数据库获取的中药成分及靶点信息及导入Cytoscape 3.9.1构建药对-有效成分-靶点网络图。“鸡血藤-络石藤”的有效成分-强直性脊柱炎的共同靶点及PPI网络构建:通过在线平台VENNY 2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)将中药靶点和疾病靶点导入获取韦恩图。交集基因利用String 11.5平台(http://cn.string-db.org)进行拓扑分析,得到蛋白质-蛋白质互作网络图。并通过Cytoscape 3.9.1根据Betweenness、Closeness、Degree数值排列筛选核心靶点。

1.4 “鸡血藤-络石藤”治疗强直性脊柱炎的GO和KEGG富集分析

运用DAVID数据平台(http://david.ncifcrf.gov/)及微生信在线平台(http://www.bioinformatics.com.cn))将获得的药物疾病交集基因进行GO功能富集分析及KEGG通路富集分析,并绘制柱状图、气泡图。

1.5 分子对接

从TCMSP中下载鸡血藤-络石藤活性成分的mol2格式文件,经chem3D软件对各成分进行能量最小化处理,用Autodock 软件对成分小分子加氢、计算电荷等处理。在PDB数据库(https://www.rcsb.org/)获取对应的核心靶点,然后在PyMOL 2.5.2软件中去除靶点中的水分子、配体,导入AutoDockTools中加氢、计算电荷,然后与小分子在Autodock vina中进行对接,对接结果用PyMOL可视化。

2 结果

2.1 “鸡血藤-络石藤”药对成分及靶点

经TCMSP筛选得到药对有效成分为31个,利用Unitprot数据库规范化处理及去重后得到144个靶点信息。见图1。

图1 鸡血藤-络石藤-成分-靶点网络图

2.2 AS相关疾病靶点

检索DisGeNET、GeneCards、DrugBank、GEO数据库,对DisGeNET以score≥0.1筛选后,整合所有数据库和去重获得2443个疾病靶点,与鸡血藤-络石藤成分靶点构建韦恩图,最终获得50个交集靶点,见图2。其中,对GSE25101进行差异分析,获得上调基因36个,下调基因95个,并绘制火山图,见图3。

图2 药对-疾病的韦恩图

图3 AS差异基因火山图

2.3 PPI网络及核心靶点

将交集靶点上传至String平台后,构建蛋白互作网络图。使用Cytoscape软件对数据进行拓扑分析。根据分析结果取degree值排名前10的核心靶点,依次为TNF、IL6、IL1B、PTGS2、MMP9、MYC、STAT3、IL4、CAT、PPARG。见图4。

图4 鸡血藤-络石藤治疗AS核心靶点

2.4 GO及KEGG富集分析

运用DAVID数据平台对交集靶点进行GO功能、KEGG通路富集分析,结果得到GO条目共378条(P≤0.05),其中BP条目308个,包括炎症反应(inflammatory response)、NF-κB转录因子活性的正向调控(positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity)等;CC条目30个,包括细胞外区域(extracellular region)、质膜(plasma membrane)等;MF条目40个,包括细胞因子活性(cytokine activity)、酶结合(enzyme binding)、5-羟色胺结合(serotonin binding)等。绘制各层面排名前10的条目成柱状图,见图5。

图5 GO富集分析

KEGG通路富集分析结果显示共有116条(P≤0.05),包括IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路(AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications)、炎症性肠病(Inflammatory bowel disease)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、松弛素信号通路(Relaxin signaling pathway)等。见图6。

图6 KEGG富集分析

2.5 分子对接结果

根据“药物-成分-靶点”网络选取degree值排名靠前的成分和靶点进行分子对接。选取TNF、IL6、IL1B、PTGS2、MMP9、MYC、STAT3、IL4、CAT、PPARG作为分子对接的靶点受体,木犀草素(luteolin)、β-谷甾醇(beta-sitosterol)、伊博格碱(Ibogain)、豆甾醇(Stigmasterol)、刺芒柄花素(formononetin)作为分子对接的小分子配体,一般认为,结合能量越低则二者结合的稳定性越高,本研究最终对接结果结合能均小于-5 kcal/mol,表明二者结合潜力较好[10]。见图7。部分分子对接结果可视化见图8。

图7 各有效成分与核心靶点的分子对接结果

图8 A:CAT- luteolin、B:MMP- luteolin对接结果展示图

3 讨论

中医古籍尚未记载“强直性脊柱炎”相关病名,现代中医根据AS临床表现将其归属于“大偻”、“尪痹”、“肾痹”等范畴,AS基本病机为督脉空虚,气血不荣筋骨,加之风寒湿邪气侵袭关节,阻遏气机,血行不畅,合而发为痹病,病久邪留正亏,瘀血内生。《症因脉治》云:“痹者,闭也,经络闭塞,麻痹不仁。”藤类药物大多以辛味为主,能够祛风除湿,通经络,《本草纲目》云:“藤类药物以其轻灵,易通利关节而达四肢”。但是中药在临床运用中应当注意用法和用量,不合理的用法用量不仅无法对疾病起到治疗作用,而且加剧毒副作用。藤类药物亦如此,诸如雷公藤在风湿免疫疾病的普遍应用,具有功效,但现代药理学研究表明,雷公藤会引起肝肾毒性[11, 12]和胃肠道反应[13]、生殖毒性[14]等不良反应。此类药物采用合适的用法往往可取得较好效果,有研究证实,雷公藤抗炎作用呈时间节律性[15],藤类药物具有多成分-多效力的特点,治疗与损伤同时出现,中医学则采取适当配伍达到增效减毒,故多以汤剂为主,但受限于煎煮方法、时间,患者依从性等条件,影响治疗有效性;而剂型的多样化,能够有效提高生物利用度[16],增加持续药效时间[17],降低毒副作用[18]。现阶段,缺乏大样本、多中心的循证证据说明不同剂型的可靠性。而网络药理学的出现则促进了中医药的发展,借助计算机网络模型的构建,为中药多成分、多靶点的特性提供了新的研究思路。

本研究通过网络药理学发现,鸡血藤-络石藤的核心成分为木犀草素、β-谷甾醇、伊博格碱、豆甾醇、刺芒柄花素等,其中以木犀草素的度值为最高,且为鸡血藤-络石藤的共同成分,木犀草素是一种广泛存在于许多中草药的黄酮化合物,具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗氧化和抗病毒等多种药理作用[19]。慢性腰背痛是AS患者迫切想解决的问题,研究发现,木犀草素恺调控P38丝裂原活化蛋白激酶信号通路,阻碍神经胶质细胞和NLRP3炎性体激活,从而发挥镇痛作用[20];动物实验证实,木犀草素可防止骨关节炎大鼠体内软骨破坏并增强胶原蛋白II表达[21]。刺芒柄花素能够有效降低骨组织MMP-9、TNF-α、IL-6的水平以抑制破骨细胞的骨吸收[22]。β-谷甾醇、豆甾醇则属于植物甾,可影响免疫细胞的活化和细胞因子的分泌,是潜在的免疫抑制剂[23]。

PPI网络中的核心靶点是TNF、IL6、IL1B、PTGS2、MMP9、MYC、STAT3、IL4、CAT、PPARG。其中TNF、IL6、STAT3是AS研究的热点,白介素-1β(IL-1β)在免疫应答中发挥着多种功能,包括诱导细胞因子产生、增强T细胞活化和抗原识别[24]。有研究表明,AS患者IL-1β与附着端炎的严重程度呈正相关[25]。MMP-9是基质金属蛋白酶(MMPs)家族中的一员,能够调节破骨细胞骨吸收活性[26],其含量与AS患者的病情呈正相关[27]。PTGS2,亦称COX-2,是环氧合酶的一种亚型,参与炎症反应、细胞增殖和凋亡等多种生物进程[28],冯思敏等[29]发现,β-谷甾醇、豆甾醇能显著下调急性结肠炎小鼠的COX-2的表达。MYC的表达水平影响大鼠髁突软骨细胞增殖、肥大和迁移[30]。

KEGG通路富集结果显示,鸡血藤-络石藤主要通过IL-17等信号通路发挥作用。炎症反应、骨破坏及病理性新骨形成是AS的主要病理特点,目前抑制IL-17的生物制剂是控制AS病情的治疗手段之一,IL-17是AS中最活跃的促炎因子之一,可诱导RANKL过度表达,导致RANKL/OPG平衡的丧失,从而刺激关节炎中的破骨细胞生成和骨侵蚀[31]。据报道,炎症性肠病患者中AS和外周关节炎的发病率显著增加[32]。肠道微生物的稳态与炎症性肠病存在着密不可分的关系,而微生物的失衡和肠道屏障功能的障碍影响免疫调节,可加速炎症因子的释放[33]。研究显示,松弛素通过诱导RANK、NF-kB、NFATc1和TRAP基因表达,参与破骨细胞的分化与成熟过程[34]。

综上所述,本文通过网络药理学研究揭示了鸡血藤-络石藤治疗AS具有多成分、多靶点、多通路的特点,信号通路涉及炎症反应、破骨细胞的分化与活性等。分子对接表明,鸡血藤-络石藤的关键成分与核心靶点对接效果良好,本研究基于网络药理学与分子对接研究探讨鸡血藤-络石藤治疗AS的作用机制,为临床医师提供了一定的理论支持,后续仍需进一步实验验证预测结果。