欧蒙免疫印迹法（ANA 谱3）模条本底颜色变深对结果影响2 例分析

章晓霞，李发爵，李湘成，陈民，苏悦，付红，彭丽平，梁小燕

（1.景德镇市第三人民医院检验科，江西 景德镇 333000；2.南昌美康盛德医学检验实验室有限公司，江西 南昌 330000；3.浙江大学医学院附属邵逸夫医院检验科，浙江 杭州 310000）

欧蒙印迹法中所包被的抗原均为生化特性明确的纯化抗原，因此具有良好的检测敏感性[1]。 操作过程中，模条本底颜色变深、扫描不报警的现象时有发生；但本底颜色很深及扫描报警，显示“不可用的”情况也偶有发生，表明实验失败，复查也如此，报告发不出。 2020 年12 月18 日和2021 年1 月1 日2 名住院患者ANA 谱3 模条 （15 项）颜色很深及扫描报警，显示“不可用的”；经进一步分析为球蛋白增多，增加了模条的吸附所至。 血清经适当稀释，减少球蛋白的含量，从而减少吸附达到可以扫描，不报警，实验成功的目的；再加做间接免疫荧光 （IIF：HEp-2 细胞），ANA 谱3 报告就可以安心发出。 现报告如下。

1 临床资料

1.1 一般资料 2 病例均来自抚州市第一人民医院住院病人，其中病例1，游某，男，51 岁，临床诊断：肺部感染、乙型肝炎后肝硬化失代偿期、低蛋白血症、胸腔积液、脾大。 病例2，罗某，女，47 岁，临床诊断：肾病综合症、狼疮性肾炎、甲减、高血压病等。

1.2 检测方法 ANA 谱3 采用欧蒙免疫印迹法，在全自动EUROBlotMadter Ⅱ仪、 佳能CanoScan LiDE120 扫描仪及配套试剂上进行；IIF 采用欧蒙试剂及EUROStar ⅢPlus 荧光显微镜上进行。 结果见表1、图1~图8。

表1 2 病例实验室检查结果

图1 第2 条模条为病例1 ANA 谱3 模条图形，本底颜色很深，未见质控带

2 讨论

病例1，ANA 谱3 模条本底颜色很深，未见质控带，扫描报警，提示“不可用的”，见图1、图2；说明实验失败，复查也如此，经与欧蒙工程师沟通，告知给病人退费。 笔者通过1:3 稀释血清，模条显示较清晰质控带，经扫描后质控带显示1 个“+”，未出现报警（正常质控带显示黑色+～+++为合格），结果为ANA 谱3 所有项目阴性，见图3、图4。 再经IIF 的验证：S＜1:100（参考值：＜1:100）、核型：阴性，见表1。最终报告该病人ANA 谱3 所有项目为阴性。

图2 病例1 模条经扫描后（黄色区域）图形，提示“不可用的”

图3 黄线上模条为病例1 血清经1:3 稀释后的ANA 谱3 模条图形，见较清晰质控带

图4 病例1 血清经1:3 稀释后的ANA 谱3 模条的扫描图形（黄线上），未见报警，质控带显示1 个“+”。结果为全阴性

病例2，ANA 谱3 模条本底颜色较深，见模糊质控带，扫描报警，提示“不可用的”，见图5、图6，说明实验失败。 通过1:2 稀释血清，模条显示较清晰质控带，经扫描后质控带显示“++”，未出现报警，结果为抗SSA、Ro-52、ds-DNA、ANuA、Histone抗体分别为1 个“+”，见图7、图8。 因血清1:2 稀释，所以该病人ANA 谱3 上述5 项抗体分别报告2 个“+”是较准确的。 IIF 结果S=1: 640、核型为均质；其它（ds-DNA（ELISA）633.34 IU/mL、荧光强阳性，也可说明这一点，见表1。

图5 第2 条模条为病例2 ANA 谱3 模条图形，本底颜色较深，见模糊质控带

图6 为病例2 模条经扫描后（黄色区域）图形，提示“不可用的”

图7 第2 条为病例2 血清经1:2 稀释后的ANA 谱3 模条图形，见较清晰质控带

图8 第2 条为病例2 血清经1:2 稀释后的ANA 谱3 模条的扫描图形，未见报警，质控带显示“++”。结果为抗SSA、Ro-52、ds-DNA、ANuA、Histone 抗体分别为1 个“+”

对于某些患者的特殊情况（例如临床用药、肝功能异常等）导致血清样本中非特异蛋白质、胆红素或血脂等含量增加， 上述物质可能会被吸附到膜片上，最终导致非特异性背景颜色的增强[1]。 病例1 乙型肝炎后肝硬化失代偿，肾功能轻度异常，肝纤4 项升高，除轻度黄疸（TBil21.7 umol/L）外、血脂偏低，球蛋白升高明显（64.3 g/L）；病例2 肾病综合症、狼疮性肾炎，胆红素、血脂正常，IgG 达到2 580 mg/dL（参考值：751~1 560 mg/dL），TP63.6g/L、ALB26 g/L、GLB37.6 g/L，也就是球蛋白升高。 所以笔者认为模条颜色变深可能主要与病人球蛋白升高相关，球蛋白越高模条颜色越深，甚至导致扫描不成功，显示“不可用的”，实验失败。 通过对血清的适当稀释，减少球蛋白的含量，从而降低模条的吸附及本底颜色，以达到可以扫描，不报警，实验成功的目的。 扫描结果×稀释倍数即为最终报告结果；加做IIF 报告可进一步增加可信度，因为HEp-2 细胞中包含100~150 种自身抗原，美国风湿病学会（ACR）已将间接免疫荧光检测推荐为检测ANA的“金标准”[2]，中国免疫学会临床免疫分会、欧洲自身免疫标准化促进会（EASI） 将其推荐为ANA检测的“参考方法”[3-5]。 值得注意的是，荧光显微镜的质量和荧光光源强度及滤光器的配置要好，否则会影响结果判断的准确性[6]。

有些研究中，在深色背景下，只要能观察到特异性抗原位置条带阳性，均可视为明确阳性；若背景颜色过深而严重影响到结果判读， 则样本不适用于该检测体系，可考虑采用其他的检测方法（如ELISA）进行检测。 但本研究中血清稀释法再加上IIF 作为补充也不失为一种简便易行的方法。 由于观察样本例数有限， 在今后的工作中增加观察例数及与临床的结合， 以对此类问题有一个比较全面的了解。