血清Smad4、TK1、VEGF 对原发性肝癌诊断及预后评估的临床价值分析

张晓华，李素娟，侯得山

（郑州煤炭工业（集团）有限公司总医院，河南 郑州 450000）

PHC 是恶性肿瘤之一， 每年的新发病例和死亡病例均超过80 万例，而我国的肝癌病例约占全球病例的一半，该病具有发病隐匿、进展迅速、恶性程度高及致死率高等特点[1-3]。 由于发病隐匿，大部分患者在患病早期没有任何临床症状， 经检查确诊时病情已发展至中晚期， 导致进行手术切除的可能性渺小。因此，如何对PHC 进行早期诊断及其预后评估对临床降低PHC 患者的死亡率有重要意义。 血清Smad4 是调节细胞侵袭迁移的重要下游信号通路，与肿瘤扩散关系密切；TK1 是嘧啶补救合成的关键酶，与肿瘤细胞的增殖具有很高的相关性[4-5]；VEGF 是最强的促新生血管形成的生长因子，在肝癌形成与进展中起关键作用[6]。 现阶段，临床关于Smad4、TK1、VEGF 三者联合诊断PHC 和预测其患者预后的报道尚少， 故本研究分析PHC患 者 血 清Smad4、TK1、VEGF 水 平 变 化 及 其 与PHC 发生和预后的关系，为PHC 的早期诊断和预后评估提供依据，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2017 年4 月至2019 年4 月医院确诊的102 例PHC 患者， 将一般资料及随访资料均完整的96 例PHC 患者纳入病例组，其中男52 例，女44 例，年龄39～70（55.42±8.17）岁。 纳入标准：经病理学检查确诊为PHC；既往没有接受过手术切除治疗；临床资料完整；患者及家属了解并积极配合研究治疗，符合《赫尔辛基宣言》相关标准。 排除标准：伴有心、肺、肾功能障碍者；有凝血功能、免疫系统疾病者；其他肿瘤或巨块型者。 选择年龄相似的健康体检者96 例作为对照组，男58例，女38 例，年龄36～73（53.48±8.36）岁。两组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

1.2 方法 （1）Smad4：于清早收集被检者的空腹外周静脉血4 mL， 以转速为3 500 r/min 离心10 min， 留取血清，-80 °C 冷藏待检， 使用酶联免疫（ELISA）法测定Smad4 水平，步骤按照检测试剂盒（美国Biolegend 公司） 的说明书严格操作。 （2）TK1： 同上收集肘部静脉血4 mL 放于真空采血管中， 室温静置30 min， 转速4 000 r/min 离心10 min，留取血清，-25 °C 冷藏待检，使用CIS-1 型化学发光数字成像分析仪测定TK1 水平， 步骤按照检测试剂盒 （深圳华瑞同康生物技术深圳有限公司）的说明书严格操作。 （3）VEGF：同上收集静脉血4 mL，室温静置30 min，转速2 500 r/min 离心15 min，留取血清，-30 °C 冷藏待检，ELISA 法测定VEGF 水平，步骤按照检测试剂盒（上海铭睿生物科技有限公司）的说明书严格操作。

1.3 治疗与随访 病例组患者确诊后均予以保肝、白蛋白补充、营养支持等对症治疗，当患者肝功能改善达到A 级，且一般情况好转后，择期进行肝切除术， 并于术后5 周开始行辅助性的经导管动脉化疗栓塞术治疗。 术后每2 个月通过门诊复查患者血清指标以及肝脏B 超， 每4 个月复查胸部X线片。 对可能复发的患者进行腹部CT 扫描和(或)MRI 检查以证实。 必要情况下，可进行超声引导下穿刺活组织病理学检查明确诊断， 随访总时间为手术后1 年或死亡。 以末次随访记录作为随访结果，患者肿瘤复发、死亡、淋巴结转移定义为预后不良，收集发生预后不良的患者数，分为预后不良组和预后良好组。

1.4 统计学处理 采用统计学软件SPSS 19.0 处理数据，计数资料采用（%）表示，行χ2检验，计量资料采用（±s）表示，t检验，采用Logistic回归分析影响患者预后的独立危险因素，P＜0.05 为差异有统计学意义。应用受试者工作特征曲线（ROC）及曲线下面积（AUC）评价各时间点Smad4、TK1、VEGF预测PHC 患者预后评估的准确度。

2 结果

2.1 病例组与对照组血清Smad4、TK1、VEGF 水平比较 病例组术后血清Smad4、TK1、VEGF 水平低于术前，差异有统计学意义（P＜0.05），且病例组术前和术后血清Smad4、TK1、VEGF 水平均高于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 病例组与对照组血清Smad4、TK1、VEGF 水平比较（±s）

表1 病例组与对照组血清Smad4、TK1、VEGF 水平比较（±s）

注：与病例组术前比较，①P＜0.05；与病例组术后比较，②P＜0.05

组别 n 观察时间 Smad4（ng/mL） TK1（pmol/L） VEGF（pg/mL）病例组96术前术后对照组96 23.65±2.63 16.87±1.51①12.54±2.14①②5.67±1.13 3.14±0.23①0.81±0.22①②206.85±29.36 158.82±11.27①84.73±13.21①②

2.2 血清Smad4、TK1、VEGF 水平及三者联合诊断PHC 的ROC曲线 根据AUC选取Smad4、TK1、VEGF 的最佳诊断截点，ROC曲线分析显示，Smad4、TK1、VEGF 联合的AUC为0.889 高于单一指 标Smad4 的0.796、TK1 的0.675 和VEGF 的0.793（Z=9.360、4.485、9.088，P＜0.05），见图1，表2。

图1 Smad4、TK1、VEGF 及联合诊断PHC 的ROC 曲线

表2 Smad4、TK1、VEGF 及联合诊断PHC 结果分析

2.3 PHC 预后不良与预后良好组血清Smad4、TK1、VEGF 水平比较 96 例PHC 患者中，24 例预后不良，其中肿瘤复发10 例，淋巴结转移8 例，死亡6 例，预后不良率为25.00%。预后不良组术前和术后血清Smad4、TK1、VEGF 水平高于预后良好组，差异有统计学意义（P＜0.05），见表3。

表3 病例组预后不良和预后良好组患者血清Smad4、TK1、VEGF 水平比较（±s）

表3 病例组预后不良和预后良好组患者血清Smad4、TK1、VEGF 水平比较（±s）

注：与预后不良组术前比较，①P＜0.05；与预后不良组术后比较，②P＜0.05；与本组术前比较，③P＜0.05。

组别 n 观察时间 Smad4（ng/mL） TK1（pmol/L） VEGF（pg/mL）预后不良组24预后良好组72术前术后术前术后33.27±7.61 19.16±1.24③20.55±3.42①16.31±1.51②③9.83±1.96 3.76±0.21③4.37±0.86①3.01±0.23②③237.21±67.09 172.14±14.25③196.15±32.21①154.48±12.08②③

2.4 血清Smad4、TK1、VEGF 水平及三者联合预测PHC 预后不良的ROC曲线 根据AUC选取Smad4、TK1、VEGF 的最佳诊断截点，ROC曲线分析显示，Smad4、TK1、VEGF 联合的AUC为0.865高 于 单 一 指 标Smad4 的0.791、TK1 的0.796 和VEGF 的0.773 （Z=8.885、9.325、8.020，P＜0.05），见图2，表4。

图2 Smad4、TK1、VEGF 及联合预测PHC 预后不良的ROC 曲线

表4 Smad4、TK1、VEGF 及联合预测PHC 预后不良结果分析

2.5 PHC 预后不良单因素分析 预后不良组的年龄、性别、巴塞罗那肝癌临床分期（BCLC）分期、肝功能Child Pugh 分级、 血小板计数与预后良好组比较，差异无统计学意义（P＞0.05）；预后不良组肿瘤最大直径、肝硬化、脉管癌栓、TNM 分期、腹腔淋巴结转移、肿瘤数目与预后良好组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），见表5。

表5 预后不良组- 预后良好组一般情况比较[n(%)]

2.6 PHC 预后不良多因素Logisitic回归分析 是否出现术后预后不良作为因变量， 以上述有统计学意义项（Smad4、TK1、VEGF、肿瘤最大直径、肝硬化、脉管癌栓、TNM 分期、腹腔淋巴结转移、肿瘤数目） 作为自变量， 对上述因素进行赋值，Smad4≤22.06 ng/mL=0，＞22.06 ng/mL=1；TK1≤8.85 pmol/L=0，＞8.85 pmol/L=1；VEG ≤192.74 pg/mL=0，＞192.74 pg/mL=1； 肿 瘤 最 大 直 径≤5 cm=0，＞5 cm=1，合并肝硬化无=0，有=1，脉管癌栓无=0，有=1，TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期=0，Ⅲ-Ⅳ期=1；腹腔淋巴结转移无=0，有=1，肿瘤数目单个=0，多个=1 并将其纳入Logisitic回归模型中，发现Smad4＞22.06 ng/mL、TK1＞8.85 pmol/L、VEGF＞192.74 pg/mL、 合并肝硬化、TNM Ⅲ-Ⅳ期是PHC 患者预后不良的独立危险因素，见表6。

表6 PHC 预后不良多因素分析

2.7 病例组不同血清Smad4、TK1、VEGF 表达状态患者生存分析 分别以血清Smad4、TK1、VEGF 表达水平22.06 ng/mL、8.85 pmol/L、192.74 pg/mL 作为截点值，将大于截点值纳入高表达，小于等于截点值纳入低表达，结果显示Smad4 高表达、TK1 高表达、VEGF 高表达者1 年无进展生存率分别为41.38%（12/29）、57.78%（26/45）、58.33%（28/48）低于低表达者89.55% （60/67）、90.20% （46/51）、91.67%（44/48）（P＜0.05）；Smad4 高表达、TK1 高表达、VEGF 高表达者1 年总生存率分别为62.07%（18/29）、73.33%（33/45）、72.92%（35/48）低于低表达 者97.01%（65/67）、96.08%（49/51）、95.83%（46/48）（P＜0.05）。 见图3。

图3 病例组不同血清Smad4、TK1、VEGF 表达状态患者生存分析

3 讨论

PHC 包括肝细胞癌、 肝内胆管癌和肝细胞胆管细胞混合癌， 其中肝细胞癌占85%~90%。 PHC的发展是一个多基因突变、 多信号通路的癌变过程，大多遵循从慢性肝炎、肝硬化、肝硬化增生结节、不典型增生结节、早早期肝癌、早期肝癌、进展期肝癌这一过程， 这是一个多步骤从分子到临床的演变过程[7-9]。 目前，针对PHC 的治疗，早期患者以手术切除和射频消融等根治性治疗为主要手段， 中晚期患者使用局部治疗联合系统治疗的方式，以有效延长患者的生存时间[10-12]。 随着医学的高速发展， 手术切除方法的切除率和整体治疗效果逐渐提高， 但是仍存在患者由于诊断延误等原因导致预后效果不理想， 因此早期诊断PHC 和预测其预后不良的发生对于提高患者的临床疗效具有重要的意义。

Smad4 是转化生长因子（TGF）-β 通路至关重要的转录调节因子，介导TGF-β 的生物学作用，当TGF-β 与其受体结合后利用Smad4 影响机体细胞内信号通路的转导，从而参与肿瘤的发生、发展，Smad4 水平的增大会促进肝癌的浸润和转移。现阶段，临床关于Smad4 与癌症的相关研究较多，韩翔[13]发现，Smad4 在淋巴结转移者中的表达明显上调，其可以通过介导信号通路促进肿瘤转移。金向宇[14]等也发现， 在肝癌患者中Smad4 表达水平明显高于健康人群，Smad4 可以参与肝癌的发展过程，与肝癌的预后有着密切的关系。 本研究同样发现，PHC 患者Smad4 呈高水平表达， 经手术后水平显著下降，其中预后良好者下降更为明显，原因可能为Smad4 降低可能导致TGF-β 超家族信号途径的抑制作用消失，从而在肿瘤发生、进展中起重要作用。 上述研究提示，Smad4 在肝癌的形成中发挥着促癌作用。

TK1 是一种细胞周期依赖酶， 主要参与细胞DNA 增殖过程。健康人细胞中的TK1 水平较低，细胞增殖过程正常，而TK1 水平的升高，可以为细胞DNA 增殖创造良好的条件， 且恶性肿瘤细胞有无限增殖的特点， 从而造成肿瘤细胞DNA 合成旺盛，促进肿瘤的发生、增殖[15-16]。目前对于TK1 如何参与肿瘤DNA 增殖的过程没有定论，但相关研究表明，其在肝癌患者体内的水平较高，且与术后的预后不良情况有关，具有预测价值[17]。 在本研究结果中，病例组TK1 水平与正常人相比明显偏高，表明肝癌组织中TK1 水平高于正常肝组织， 另外，PHC 预后不良者的TK1 水平要高于预后良好者，说明伴随TK1 的升高预后不良的概率会增大。

除了血清Smad4 和TK1 外， 有研究证实VEGF 可以作为评估患者病情发展及预后的参考指标[18]。 VEGF 是一种促血管内皮增殖的重要因子，可以与多种血管生成因子相互作用， 促进新血管的生成和血管内皮的增大，为肿瘤生长提供基础，直接影响肿瘤细胞的分化迁移，VEGF 水平的增高可以促进肿瘤细胞的增殖[19]。 本研究结果提示，血清VEGF 水平可以用于肝癌病情评估，推测VEGF通过加速心血管生成促进肿瘤的增殖， 与PHC 的发展和预后相关，随着VEGF 水平升高，患者预后越差，此结果与既往杨锦锋等[20]研究结果一致。

为了进一步探讨Smad4、TK1、VEGF 与PHC发生及预后的关系， 本研究通过ROC曲线进行分析， 结果发现，Smad4、TK1、VEGF 联合检测诊断PHC 的AUC高于三者单一检测， 且Smad4、TK1、VEGF 联合预测预后不良的准确性优于单一检测的准确性，表明Smad4、TK1、VEGF 联合对PHC 患者的早期诊断和预后评估具有临床应用价值，目前尚无文献有类似报道。 考虑到PHC 的预后可能与患者的临床特征有关， 本研究根据预后情况进一步Logistic回归分析，结果显示，除了合并传统肝硬化、TNM Ⅲ-Ⅳ期因素外，Smad4＞22.06 ng/mL、TK1＞8.85 pmol/L、VEGF＞192.74 pg/mL 也是影响PHC 预后的独立危险因素， 由此可见，PHC 预后情况与血清Smad4、TK1、VEGF 水平有关， 进一步比较血清Smad4、TK1、VEGF 水平高表达与低表达患者生存情况， 结果显示高表达患者无进展生存率与总生存率均低于低表达患者， 说明临床可以通过对Smad4、TK1、VEGF 的检测和识别进行早期的临床干预，改善患者的预后情况。 王征夏等[21]研究发现， 肝硬化、TNM 分期与PHC 患者发生不良预后有关，本研究结果与其一致，关于合并肝硬化、TNM Ⅲ-Ⅳ期因素为PHC 预后不良的危险因素的研究已有较多，在此不再过多描述。

综上所述，PHC 患者伴随Smad4、TK1、VEGF水平上升， 且预后不良者上升更加明显， 三者与PHC 的发生、预后密切相关，可以作为临床预测患者预后的重要血清学指标。