SARS-CoV-2 核酸提取前样本混匀后不同静置时间对假阴性结果影响的初步探讨

梁丽霞

（肇庆市第一人民医院检验科，广东 肇庆 526060）

SARS-CoV-2 核酸RT-PCR 是目前COVID-19 病[1]的确诊方法，但影响检测结果的因素较多。我们在实验室核酸检测工作中发现， 样本提取前充分振荡混匀后静置时间对治疗后期或恢复期的确诊患者的实验结果有着很大的影响。 在患者治疗后期及恢复期，病毒量急剧减少，但仍有少量存留于鼻咽内部细胞的情况下， 不同的样本处理方法决定着结果的可靠性。 实验结果报告如下：

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂与仪器3 mL 自带灭活效果的病毒保存液（广州邦德盛生物科技有限公司），去RNA 酶EP管（AXYGEN），半自动核酸提取仪（重庆中元汇吉生物技术有限公司）和配套的核酸提取试剂盒（磁珠法，型号B-200），SARS-CoV-2 核酸检测试剂盒（荧光PCR 法，中山大学达安基因股份有限公司），ABI7500 PCR 仪（Applied Biosystems USA）。

1.1.2 样本来源 样本来源于本院收治的1 例女性COVID-19 确诊患者， 该患者住院时间是2020 年2 月17 日至3 月5 日，入院前鼻塞、流涕、咽痛8天，咳嗽7 天，发热3 天，新型冠状病毒核酸检测结果阳性，胸部CT 平扫结果提示左肺上叶少许炎症。 在此病人住院治疗期间，感染科医生为了监测治疗效果，在病人签署知情同意书的情况下，每天采集一个鼻咽拭子到我们实验室进行新型冠状病毒核酸检测， 采集后的样本立即保存在灭活病毒保存管中，4 ℃保存及时送检。 将此病人入院后治疗的前6 d 设为治疗初期，这期间送检的6 个鼻咽拭子分别编号为1、2、3、4、5、6，设为A 组。 在出院前一周的治疗设为治疗后期， 这期间送检的6 个鼻咽拭子分别编号为7、8、9、10、11、12，设为B 组。

1.2 方法

1.2.1 加样提取操作 实验人员严格按照《国家卫生健康委办公厅关于印发新型冠状病毒实验室生物安全指南（第二版）的通知》及《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南（第四版）》相关文件进行实验操作和生物安全防护。

取出含提取试剂96 孔的深孔板平衡至室温，小心撕开铝膜， 样本孔位依次加入15uL 的Proteinase K。

将A 组和B 组的12 个3 mL 的样本充分混匀后， 每个样本以每管200 uL 的液量分装到四个不同的1.5 mL EP 管中。 实验的步骤如下：

（1）第一管立刻进行提取；

（2）第二管静置5 min 后进行提取；

（3）第三管静置15 min 后进行提取；

（4）第四管静置30 min 后进行提取。文中将以0 min、5 min、15 min、30 min 表示不同的静置时间。

1.2.2 核酸扩增 使用PCR 仪，根据核酸检测试剂盒说明书设置反应程序，利用一步法反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术，选取SARS-CoV-2 病毒的ORF1ab 和N 基因作为扩增靶区域， 设计特异性引物及荧光探针用于SARS-CoV-2 检测。 试剂盒同时包括了内源性内标系统，用于对标本采集、核酸提取过程及PCR 扩增过程的监控。

1.2.3 PCR 反应条件 50 ℃的初始反转录15 min，紧随95 ℃变性步骤15 min，随后进行45 次94 ℃循环15 s，55 ℃45 s，最后一步40 ℃20 s。

1.2.4 结果判定 阴性结果：N 基因和ORF1ab 基因无典型S 型扩增曲线或Ct>40，且Cy5 通道有明显扩增曲线； 阳性结果：（N 基因和ORF1ab 基因Ct≤40，且有典型的S 型扩增曲线。 如果N 基因或ORF1ab 基因Ct≤40，） 复检后结果一致可判为阳性。 要求阴性质控和阳性质控均在控。

1.2.5 统计学方法 比较扩增后A 组N 基因和ORF1ab 基因Ct，Pearson积矩相关分析不同标本之间的CT 系数，graphpad5.0 对图形进行了说明，MedCalc 软件绘制Bland-Altman 曲线，并对CT 进行一致性分析，P<0.05 为差异有统计学意义。 因B组部分样本N 基因和ORF1ab 基因结果出现假阴性结果，没有Ct，只能用excel 2016 比较阳性率。本研究采用统计分析软件spss 19.0。

2 结果

2.1 治疗初期A 组提取核酸前不同静置时间处理的Ct：见表1。

表1 COVID-19 确诊患者治疗初期A 组样本提取核酸前不同静置时间处理的Ct

2.2 相关分析 治疗初期A 组的6 个样本0 min与5 min、15 min、30 min 扩增后Ct 的相关分析，结果如表2。 N 基因Ct0 min 和5 min 比较差异有统计学意义（P<0.05），而与15 min、30 min 比较差异无统计学意义（P>0.05）。 ORF1ab 基因Ct0 min 与5 min、15 min 比较有统计学差异 （P<0.05）， 而与30 min 比较差异无统计学意义（P>0.05）。随着标本静置时间不断延长，相关系数就越小，比较差异无统计学意义。 见图1。

图1 治疗初期A 组0 min 与其他三种不同静置时间提取的Ct 相关性分析（N 基因和ORF1ab）

表2 COVID-19 确诊患者治疗初期A 组样本提取核酸前不同时间处理方式的Ct 相关性分析

2.3 一致性分析 样本充分混匀即刻加样提取（0 min）与混匀后静置5 min、15 min、30 min 提取扩增后Ct 的一致性分析。 纵轴是0 min 与其他三种处理方式的差值，横轴是平均值。 如图2 Bland-Altman 曲线所示，N 基因的Ct，0 min 与其余3 种 不同静置时间进行两两比较， 图中所有的点都在95%LoA 之内，认为方法之间结果具有较好的一致性。（ORF1ab 基因的Ct 都在混匀后静置30 min 提取有16.7%（1/6）的散点分布在95%CI之外，）样本充分混匀即刻加样提取0 min 与静置30 min 提取两种方法的一致性较差。

图2 治疗初期A 组混匀即刻加样提取（0 min）与不同静置时间的相关性分析图图例：横轴表示混匀即刻加样提取（0 min）的Ct 值，纵轴表示不同静置时间提取样本的Ct 值（N 基因和ORF1ab）

2.4 治疗后期B 组样本提取核酸前不同静置时间处理的Ct：见表3。 图3、图4 和图5 所示，治疗后期的同一个样本N 基因和ORF1ab 基因由于提取前静置时间不同而出现假阴性的结果。 在静置30 min 加样提取，它的阳性率结果是最高的。

图3 治疗后期B 组样本不同处理方式N 和ORF1ab 基因阳性率比较柱状图

图4 治疗后期B 组样本不同处理方式N 基因Ct变化折线图

表3 COVID-19 确诊患者治疗后期B 组样本提取核酸前不同静置时间处理的Ct

3 讨论

病毒保存溶液通常分为非灭活型和灭活型。非灭活型能够保护病毒的蛋白质和核酸， 收集样品后，必须严格遵循低温条件才能长期保存。 灭活型主要是从核酸提取裂解物中改良的病毒裂解型包含RNase 酶抑制剂的保存溶液， 有助于保护病毒核酸不被降解， 可以在室温下保存相对较长的时间。 我院曾报道灭活型和非灭活型的样本，在检测新型冠状病毒RNA 上无论是N 基因还是ORF1ab 基因结果都具有一致性[2]。 然而也有研究表明， 病毒灭活过程对于病毒含量较高的样本检出率无显著影响， 但可能会导致病毒含量较低样本的检出率下降，从而产生假阴性结果[3]。 考虑到SARS-COV-2 潜在致病能力较强， 在实验室生物安全水平有限的情况下必须进行病毒灭活过程，但应尽量准确控制灭活的温度和时间， 以避免因高温度或长时间的灭活过程而导致检出率严重下降的情况[4-6]。

COVID-19 患者存在康复后复发和无症状感染等现象。 一项关于回顾性分析3 例COVID-19患者出院后核酸检测结果复阳的研究指出， 患者感染初期的SARS-CoV-2 ORF1ab 和N 基因的核酸检测结果呈双基因强阳性， 二次入院时报告双基因为弱阳性， 提示了患者复阳的病毒载量远低于首次入院时的病毒载量[7]。 本文通过对治疗初期A 组与治疗后期B 组样本经不同样本处置方式，发现COVID-19 患者因不同病毒载量而影响了结果。 在患者的治疗初期，由于其病毒核酸载量比较高， 样本振荡后不同静置时间对结果无影响。 然而，在治疗后期，同一样本因提取前不同的静置时间而出现截然不同的结果， 放置30 min 后提取的结果阳性率却是最高的， 这说明了样本提取前不同的处置方法对假阴性结果有一定的影响。 实验前标本保存液总量是3 mL， 实验前有无振荡对结果的影响不大， 结果与病毒核酸载量以及与在采样管中的悬浮性有关。 另一方面，体外诊断试剂的分析敏感性是有极限的[8]，原始标本中病毒数量低于一定程度， 就很可能在核酸扩增检测的反应体系中没有病毒核酸，试剂也就无法检出，试剂因素也是影响实验结果的重要因素之一， 尤其是当样本有不同的处理方式时， 试剂因素对实验结果的影响就突显出来了。

有报道称，COVID-19 患者在症状消失后的一段时间内仍可检测出病毒的RNA[9-10]。 冯毅[11]报道了湖北武钢第二职工医院38 例确诊病例同步检测咽拭子核酸检测和胸部CT， 第1 次核酸检测阳性病例9 例， 第2 次核酸检测结果阳性病例25例，第3 次核酸检测结果阳性病例4 例。 LAN 等[12]研究证实，4 例COVID-19 患者在出院5～13d 后出现核酸“复阳”。COVID-19 患者经过治疗症状消失后，排毒仍继续，体内仍携带较低滴度的病毒，这可能与病程不同阶段的核酸载量有关。 另一方面，核酸检测试剂的灵敏度、 实验人员的操作方法等实验因素也会导致核酸漏检和假阴性， 使部分患者在痊愈前出院，导致出现“复阳”现象[13-14]。 有研究分析了出院前连续核酸检测阴性次数对出院后复阳的影响， 结果显示连续3 次及以上核酸检测阴性可大大降低复阳比例， 这对今后的疫情防控有很好的提示作用[15]。

新型冠状病毒核酸检测应严格按照SOP 进行实验，采样使用灭活采样管，尤其是疾病治疗后期和疑似病例的样本应充分震荡并静置30 min 后再进行下一步提取和扩增实验， 这样做能有效避免气溶胶的发生， 也对避免假阴性结果具有一定的应用价值。 我们医院收治的新型冠状病毒患者数量不多，本研究存在一定的局限性，研究结论尚需进一步验证。