不同稀释介质对乙型肝炎病毒表面抗原定量检测的影响

陈明心，王炜，张岱，任伟宏

（河南中医药大学第一附属医院，河南 郑州 450000）

在目前临床检验工作中， 血清HBsAg 浓度已经可以使用全自动化免疫检测系统进行检测，但是很多检测体系的检测范围（例如雅培）仅仅为<250 IU/mL，而在一些流行病学的调查中发现，很多乙肝患者的血清HBsAg 浓度能达到50 000 IU/mL的水平，甚至更高[1]。因此，需要将高浓度HBsAg 血清稀释到检测系统的线性范围内进行检测。 已有的研究发现[2-3]，不同的稀释液介质会对稀释后的检测结果造成较大的影响， 而导致达不到稀释检验基本要求，影响最终结果。

LiCA500 光激化学发光系统是一种较新的检测系统，采用的是均相检测方法[4-5]。 目前该系统对HBsAg 的检测线性范围只能达到500 μg/L 的水平，不能满足对HBsAg 高浓度样本检测的需求，且试剂供应方未提供配套样本稀释液。 目前临床常用稀释液有生理盐水和阴性血清，有研究报道，生理盐水在其他免疫检验项目中稀释效果不理想[6]。本研究尝试探索寻找影响HBsAg 稀释结果的主要成分，从而找到一种理想的HBsAg 定量稀释液。

1 材料和方法

1.1 标本选取 选取LiCA500 上检测HBsAg 为阳性的样本50 份（HBsAg 血清浓度覆盖0.2～500 μg/L 范围）, 无明显溶血、 脂血和胆红素血； 另选择HBsAg 浓度较高的病人血清（>500 μg/L）51 份，各自随机寻找阴性血清将其进行稀释配制成混合血清，该51 份混合血清浓度覆盖0.2～500 μg/L 范围。

1.2 稀释液 选取四种稀释液：（1）0.85%~0.90%的生理盐水；（2）BSA， 可根据需要配制成不同浓度；（3）BGG，可根据需要配制成不同浓度；（4）随机阴性血清（要求HBsAg 和HBsAb 同时为阴性）

1.3 仪器 光激化学发光全自动免疫分析仪器（Li-CA500，博阳公司）

1.4 试剂 LiCA500 配套HBsAg 检测试剂，包含试剂A 和试剂B，以及LiCA 检测系统共用通用液

1.5 实验方法

1.5.1 不同稀释介质对稀释结果的影响 将101 份HBsAg 阳性样本分别用生理盐水，50 g/L BSA、15 g/L BGG 以及随机阴性血清进行3 倍稀释。 稀释方法为病人血清30 μL +稀释液60 μL，充分混合均匀后,使用LiCA500 检测。按照试剂配套说明书，检测过程为加入25 μL 样本、25 μL 试剂A、25 μL 试剂B，反应15 min 后，加入175 μL 通用液，反应17 min 后，由仪器检测发光值，再根据校准曲线自动获得HBsAg 浓度， 将以上稀释后得到的检测结果乘以3， 得出通过稀释后计算获得的HBsAg 浓度（以C1 来表示），而未稀释的原始样本直接检测的浓度以C2 表示，根据CLSI EP7-A2 文件使用公式计 算 稀 释 检 测 带 来 的 偏 差：D=|（C1- C2）/ C2|100%，设定D 在20%以内为合格，观察各稀释组有多少结果可以达到合格。

1.5.2 同一蛋白稀释介质不同浓度对稀释结果的影响 选取10 份HBsAg 阳性样本 （其浓度覆盖0.2~500 μg/L 范围），分别用80 g/L、60 g/L、40 g/L、10 g/L 的BSA，以及20 g/L、15 g/L、10 g/L、5 g/L 的BGG 进行稀释， 将不同浓度BSA 以及不同浓度BGG 稀释后得到的结果分别除以未稀释时的相应的原始检测结果， 得出稀释3 倍后的检测结果相对于未稀释检测结果的降幅， 对不同浓度的同种基质的稀释液之间的稀释结果进行相关分析。 并将其分析结果进行比较。

1.5.3 动力学分析 选取15 份HBsAg 阳性样本（其浓度覆盖0.2~500 μg/L 范围） 分别用生理盐水、50 g/L BSA、15 g/L BGG、 以及阴性血清稀释3倍，稀释后上机进行检测，在加入通用液后，分别将孵育时间控制在17 min （总反应时间为32 min）、47 min（总反应时间为62 min）、62 min（总反应时间为77 min） 和77 min （总反应时间为92 min） 进行检测。 并分别用总反应时间62 min、77 min 和92 min 时测得的发光信号值除以总反应时间32 min 时测得的发光信号值，计算各自的增幅。

1.5.4 统计分析 使用统计软件SPSS 24.0 进行统计分析， 不同稀释介质对101 例样本稀释结果采用单因素方差分析，并用LSD 法做两两比较。 同一种蛋白不同浓度稀释结果采用回归分析。 动力学结果，不同介质稀释组92 min 相对于32 min 的增幅采用单因素方差分析，并用LSD 法做两两比较。

2 结果

不同稀释液稀释后偏差在20%以内的样本例数见图1。15 g/L BGG 稀释后偏差在20%以内者最多。 各不同稀释液稀释所得回收率偏差结果如图2，通过单因素方差分析，非混合样4 组稀释结果的F为35.830，P为0.000，混合样4 组稀释结果的F为91.706，P为0.000，说明无论混合样本还是非混合样本，4 组稀释得到的回收率偏差整体均有显著性差异，进一步做LSD 检验，15 g/L BGG 和生理盐水组以及50 g/LBSA 组均有显著性差异，无论是非混合样本还是混合样本均是15 g/L BGG 稀释所得回收率偏差最小。

图1 不同稀释组回收率偏差小于20%的样本所占比例

图2 101 例样本经4 种稀释液稀释后回收率偏差的对比

对BSA 不同浓度与各浓度稀释后的降幅之间进行相关分析， 其相关系数为-0.088，P为0.589，无明显差异； 对BGG 不同浓度与各浓度稀释后的降幅之间进行相关分析， 其相关系数为-0.744，P为0.000，有明显差异。 当BSA 作为拥挤分子时随着稀释液中BSA 浓度的增加， 结果仅仅出现了轻度的下降，并未出现明显大幅度的改变。当BGG 作为拥挤分子时随着稀释液中BGG 浓度的增加， 从5 g/L 增加至20 g/L 时， 稀释结果下降了接近50%。见图3。

4 组稀释液对样本进行3 倍稀释后， 62 min、77 min、92 min 各自相对32 min 的增幅见图4。 在77 min 至92 min 时间段的增幅较为接近， 从而认为在92 min 时，抗原抗体结合反应接近达到平衡，本次研究拟将92 min 作为反应平衡点。 4 个稀释组92 min 相对于32 min 的增幅，见图5，通过单因素方差分析，F为27.358，P为0.000， 说明4 组在92 min 得到的增幅整体有差异， 进一步进行LSD 检验，15 g/L BGG 组和其他组之间均有明显差异，结合图3 所示，可以看出在92 min 时，生理盐水稀释组和50 g/L 稀释组的增幅接近，15 g/L BGG 稀释组的增幅是最大的。

图4 HBsAg 阳性样本经4 种稀释液稀释后延长反应时间相对反应32 min 增幅

图5 不同稀释组92 min 相对于32 min 的增幅

3 讨论

目前已经证实， 在稀释液中存在的各种反应成分以外的基质成分会对反应速度造成影响，通常将这些基质成分称为拥挤分子[7]，稀释液中的拥挤分子如果足以改变抗原抗体反应的速度， 则可能造成HBsAg 稀释结果的不准确。 血清中含量最多的成分是蛋白质，浓度可达到60~80 g/L，由此推测， 有可能是血清中其他蛋白质作为拥挤分子对HBsAg 和其抗体结合速度造成了影响。 血清蛋白质主要成分为白蛋白和γ 球蛋白，还有少部分的α球蛋白和β 球蛋白， 因此分别选择BSA 和小牛血清γ 球蛋白作为稀释液成分， 模拟人血清不同种类蛋白质来观察其对稀释效果的影响。 由于人血清中白蛋白含量[8]约为40~60 g/L，平均浓度为50 g/L，因此将BSA 稀释液浓度控制在50 g/L。人血清中IgG 含量[9]约为为8~16 g/L，平均浓度约为12 g/L，而血清中IgG 含量约占γ 球蛋白的80%，因此将BGG 稀释液浓度控制在15 g/L。 为了更好地证明稀释液的稀释效果，除了随机选取了50 例在0~500 ng/L 的HBsAg 阳性样本外， 还将较高浓度的HBsAg 阳性血清用其他阴性血清进行稀释配制成混合血清， 将混合血清浓度稀释在0.2~500 μg /L的范围内。 一份混合血清往往代表了两到三份样本的综合情况，可更好地减弱一些随机基质效应。从本次实验的结果看， 相对分子量较小的BSA 和生理盐水的稀释效果接近， 回收率偏差远不能达到预期。 而相对分子量较大的BGG 则稀释效果较好， 近80%的样本可以达到80%~120%范围以内。阴性血清稀释效果出现了较大差异。

将BSA 和BGG 的梯度拉开后，BSA 不同浓度的稀释液稀释结果相差不大， 浓度达到80 g/L 后略有下降。 而BGG 浓度从5 g/L 增加至20 g/L 时，稀释结果下降了约50%。 由此，可认为模仿人γ 球蛋白的BGG 在稀释过程中是影响稀释效果是否能够符合预期的主导影响因素。 造成该种现象的原因可能是，γ 球蛋白由于分子量较大， 因此是血液粘度的主要决定因素[10-11]。 而血液粘度决定了分子的扩散受到的摩擦力从而影响扩散速度, 且血清中的HBsAg 大多不是单纯的游离形式存在的蛋白，而是病毒小圆颗粒表面的蛋白质[12],大颗粒物质更容易受到摩擦力的阻滞作用， 导致抗原抗体相遇的速度更慢。作为对比，蛋白成分BSA 并非影响分子扩散的主要影响因素。

为了进一步验证BGG 对扩散的影响。 本次实验进一步进行了动力学观察。 针对不同稀释液稀释的样本， 采用增加孵育时间的方法观察其检测结果的变化。 如果是影响扩散的情况下，则在较早的时间点中，抗原抗体相遇较少，形成的复合物也较少，但是抗原抗体的总量并未发生变化，只是结合速度发生了改变，因此延迟孵育时间，使其能够充分结合而达到反应平衡之后， 则在第一次检测到达到反应平衡这段时间中BGG 稀释的样本会有更多的抗原抗体复合物形成， 因此其增幅与生理盐水稀释样本以及BSA 稀释样本相比明显较大，与随机选取的阴性血清相比也较大， 这可能和阴性血清稀释结果不稳定的情况有关， 里面可能还会存在一些未知因素的干扰， 这些仍需进一步研究。 由以上推测，BGG 稀释组中HBsAg 和其抗体的整体扩散速度应低于生理盐水稀释组和BSA 稀释组，BGG 可能具备和血清中γ 球蛋白较为接近的控制HBsAg 和其抗体扩散的能力， 从而得到了较好的HBsAg 定量稀释结果。