基于网络药理学及体内外实验探讨粉防己碱抗黑色素瘤增殖、迁移、侵袭的作用及机制

梁娇，茆文莉，张力升，侯聪艳，陈思柔，张韧，何彦丽（广州中医药大学基础医学院，广东广州 510006）

黑色素瘤是起源于表皮黑素细胞的恶性肿瘤，恶性程度高，具有高度侵袭性，其死亡率逐年升高，尚缺乏特效的治疗手段。目前临床上常使用放化疗及靶向治疗，但容易产生不良反应和耐药。因此，寻找新型、安全、有效的抑制黑色素瘤生长，减少其转移、复发的药物具有重要意义。粉防己碱又名汉防己甲素，是从中药粉防己（StephaniatetrandraS.Moor）根中提取的一种双苄基异喹啉类生物碱（结构见图1），具有抗肿瘤、抗炎、抗过敏、免疫抑制、钙通道阻滞剂、抗氧化、抗菌等药理作用[1]。其能通过诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，抑制其增殖、迁移、侵袭，逆转多重耐药性等途径，对肺癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌等多种肿瘤的发生发展具有抑制作用[1-2]。目前，粉防己碱对黑色素瘤转移的作用及机制尚未见报道。因此，本研究拟观察粉防己碱对小鼠黑色素瘤细胞B16增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT）方面的作用，并通过网络药理学及分子对接方法探讨其作用机制，通过体外实验对相关通路进行验证，以期为粉防己碱抗黑色素瘤的药理研究及临床应用提供参考。

图1 粉防己碱的化学结构Figure 1 Structure of tetrandrine

1 材料

1.1 细胞及动物小鼠黑色素瘤B16细胞，购自美国ATCC 细胞库，由本实验室传代培养。SPF 级雄性C57BL/6J 小鼠18 只，体质量20～24 g，7～8 周龄，实验动物生产许可证号：SCXK（粤）2018-0034，动物质量合格证号：44005800013707。本实验经广州中医药大学实验动物伦理委员会批准，批文号：20211230007。

1.2 药物及试剂粉防己碱（批号：A0065，纯度≥98%），成都曼思特生物科技有限公司；AKT 激动剂SC79（批号：SF2730，纯度≥98%），上海碧云天生物科技有限公司；CCK-8 细胞活力检测试剂盒（批号：MA0218），大连美仑生物技术有限公司；BCA 蛋白定量检测试剂盒（批号：KGP903），南京凯基生物科技公司；E-钙黏蛋白（E-cadherin，批号：3195）、N-钙黏蛋白（N-cadherin，批号：13116）、波形蛋白（Vimentin，批号：5741）、p-AKT（批号：4060）、AKT（批号：4691）、CREB（批号：9197）、p-CREB（批号：9198）、NF-κB p65（批号：8242）、p-NF-κB p65（批号：3033）、GAPDH（批号：5174）抗体，均购自美国CST 公司；羊抗兔IgG 二抗（批号：AS014），武汉爱博泰克生物科技有限公司。

1.3 主要仪器FORMA 371 型细胞培养箱，美国Thermo Fisher 公司；Cence L600 型自动平衡离心机，湖南湘仪仪器有限公司；iMark型酶标仪、Powerpac300型电泳仪，美国Bio-Rad公司；Eclipse TS100-F型倒置显微镜，日本尼康公司；Tanon-5200 型全自动化学发光图像分析系统，上海天能科技有限公司；Gene Speed 1730R型高速离心机，上海基因科技有限公司。

1.4 数据库及软件CTD 数据库（http：//ctdbase.org）、SwissTargetPrediction数据库（http：//www.swisstargetprediction.ch）、 Similarity Ensemble Approach 数据库（http：//sea.bkslab.org）、GeneCard数据库（https：//www.genecards.org）、UniProt 数据库（https：//www.uniprot.org）、Venny 可视化分析平台（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）、STRING 数据库（https：//www.string-db.org）、DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/tools.jsp）、微生信在线平台（http：//www.bioinformatics.com.cn）、PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）、RCSB PDB数据库（https：//www1.rcsb.org），以及Cytoscape 3.7.1 软件、OpenBabel 3.1.1 软件、AutoDock 软件。

2 方法

2.1 CCK-8 法检测细胞增殖情况收集对数生长期的B16细胞，以每孔100 μL体积（细胞数为2×103个）接种于96 孔板中；细胞贴壁后，分别加入终浓度为0、2、4、6、8、10 μmol·L-1粉防己碱干预24、48 h；然后加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃下孵育3 h后，采用酶标仪测定450 nm 波长下的各孔吸光度（A）值。计算：细胞相对活力（%）=（A实验组/A对照组）×100%，以及半数抑制浓度（IC50）。

2.2 平板克隆形成实验收集对数生长期的B16 细胞，接种在6 孔板（每孔1×103个），培养箱过夜培养；然后分别加入不同浓度粉防己碱（1、2、4 μmol·L-1）干预，对照组加入1% DMSO；3 d 更换1 次培养液，培养10 d后，弃上清；4%多聚甲醛溶液固定30 min，采用结晶紫染色后在倒置显微镜下观察并拍照，计算细胞集落形成能力。

2.3 细胞划痕实验收集对数生长期的B16细胞，接种于6 孔板（每孔6×105个），待细胞铺满后进行划痕操作；加入不同浓度的粉防己碱（1、2、4 μmol·L-1）继续培养，对照组加入1% DMSO；采用倒置显微镜于0、12、24 h观察并拍照。计算：细胞划痕愈合率（%）=（对照组划痕宽度/实验组划痕宽度）×100%。

2.4 Transwell 小室侵袭实验收集低血清培养12 h后的B16细胞，用无血清培养基重悬；以每孔200 μL（5×104个）细胞悬液接种到铺有Matrigel 胶的24 孔板上室内，下室加入700 μL 含药（1、2、4 μmol·L-1粉防己碱）培养基，对照组加入1% DMSO；孵育24 h后，用棉签擦去上室细胞，然后用4%多聚甲醛溶液固定；再用0.1%结晶紫染色后，在显微镜下拍照记录，采用ImageJ 软件分析结果。计算：细胞侵袭率（%）=结晶紫染色面积/小室面积×100%。

2.5 Western Blot 法检测B16 细胞EMT 相关蛋白的表达水平收集对数生长期的B16细胞，接种于6孔板（每孔1.5×105个）；培养过夜后加入不同浓度的粉防己碱（1、2、4 μmol·L-1），对照组加入1% DMSO；继续培养24 h 后，加入含1%PMSF 的RIPA 裂解液，提取总蛋白并采用BCA 法测定蛋白浓度。蛋白上样量为30 μg，通过SDS-PAGE 凝胶电泳，将蛋白转移到PVDF膜；用5%脱脂奶粉封闭3 h后，分别加入E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH 一抗（1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；洗膜后，加入HRP 标记的二抗（1∶5 000），室温下孵育1 h；TBST 洗膜，采用ECL 化学发光显影，扫描；使用ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

2.6 小鼠黑色素瘤肺转移观察实验取18 只7～8 周龄C57BL/6J 雄性小鼠，尾静脉注射2×105个B16 细胞，复制小鼠黑色素瘤肺转移模型。将造模小鼠随机分为3组：模型对照组（生理盐水）、粉防己碱低剂量组（50 mg·kg-1）和粉防己碱高剂量组（100 mg·kg-1），每组6 只。随即开始粉防己碱灌胃给药，每2 d 灌胃1 次，连续2 周。给药结束后，小鼠颈椎脱臼处死，剥取肺部组织、拍照，观察并计数肺部转移的肿瘤结节数。

2.7 粉防己碱治疗黑色素瘤的关键靶点收集与筛选通过CTD、SwissTargetPrediction 和Similarity Ensemble Approach数据库检索粉防己碱的作用靶点；以“Melanoma”为关键词，通过GeneCards 数据库获取黑色素瘤的疾病相关靶点；对粉防己碱作用靶点与黑色素瘤疾病相关靶点取交集，所得交集基因即为粉防己碱治疗黑色素瘤的潜在作用靶点。利用UniProt 平台对上述基因名称进行规范。

2.8 蛋白互作（PPI）网络构建将粉防己碱治疗黑色素瘤的潜在作用靶点导入STRING 数据库进行PPI 网络分析；将网络数据结果保存为“TSV”格式文件，导入Cytoscape 3.7.1 软件中，构建PPI 网络。运用Cytoscape 3.7.1 软件内置工具分析PPI 网络的拓扑参数，包括连接度（Degree）、介度（Betweenness）及紧密度（Closeness），并根据网络拓扑学参数判断核心靶点。

2.9 GO 功能及KEGG 通路富集分析将粉防己碱治疗黑色素瘤的潜在作用靶点导入DAVID 数据库，进行GO功能及KEGG通路富集分析。GO功能分析主要包括生物过程（Biologicalprocess，BP）、分子功能（Molecular function，MF）和细胞组分（Cell component，CC）。通过微生信平台对数据结果进行可视化处理，并分析粉防己碱抗黑色素瘤的作用机制。

2.10 分子对接选择PPI网络中的潜在核心靶点与粉防己碱进行分子对接验证。利用PubChem 数据库下载粉防己碱的三维结构SDF 格式文件；通过OpenBabel 3.1.1 软件转化成Mol2 格式，即小分子配体；通过PDB 数据库获取核心靶蛋白的三维结构PDF格式文件，即大分子受体蛋白；最后，将小分子配体与大分子受体蛋白通过AutoDock软件进行分子对接。

2.11 Western Blot 法检测B16 细胞AKT/NF-κB/CREB 通路相关蛋白表达①收集对数生长期的B16细胞接种于6 孔板（每孔1.5×105个），培养过夜；然后加入不同浓度的粉防己碱（1、2、4 μmol·L-1）干预，对照组加入1% DMSO；继续培养24 h后，收集各组细胞，按照“2.5”项下方法检测AKT、p-AKT、NF-κB p65、p-NF-κB p65、CREB、p-CREB蛋白表达情况。②收集对数生长期的B16细胞接种于6孔板（每孔1.5×105个），培养过夜；将细胞分为3 组，分别加入2 μmol·L-1粉防己碱、5 μmol·L-1SC79、2 μmol·L-1粉防己碱+5 μmol·L-1SC79；继续培养24 h 后，收集各组细胞，按照“2.5”项下方法检测p-AKT、p-NF-κB p65、p-CREB蛋白表达情况。

2.12 统计学处理方法采用Graphpad Prism 8.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用Turkey 检验；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 粉防己碱对B16 细胞增殖及其克隆形成的影响结果见图2、图3。与对照组（0 μmol·L-1）比较，4、6、8、10 μmol·L-1粉防己碱组的细胞相对活力均显著降低（P＜0.001），且呈现浓度依赖性。粉防己碱干预24、48 h 的IC50分别为4.273、4.085 μmol·L-1。因此选取终浓度分别为1、2、4 μmol·L-1的粉防己碱进行后续实验。与对照组比较，1、2、4 μmol·L-1粉防己碱组的细胞集落形成能力显著降低（P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，粉防己碱对B16细胞增殖具有明显抑制作用。

图2 不同浓度粉防己碱（Tet）对B16 细胞增殖的影响（±s，n=6）Figure 2 Effect of tetrandrine on the proliferation of B16 cells（±s，n=6）

图3 粉防己碱（Tet）对B16 细胞集落形成能力的影响（±s，n=6）Figure 3 Effect of tetrandrine on the colony formation of B16 cells（±s，n=6）

3.2 粉防己碱对B16 细胞迁移、侵袭能力的影响结果见图4、图5。与对照组比较，1、2、4 μmol·L-1粉防己碱浓度组的细胞划痕愈合率、细胞侵袭率均显著降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，粉防己碱能有效抑制B16细胞的迁移及侵袭。

图4 粉防己碱（Tet）对B16 细胞迁移能力的影响（×100；±s，n=3）Figure 4 Effect of tetrandrine on the migration ability of B16 cells（×100；±s，n=3）

图5 粉防己碱（Tet）对B16 细胞侵袭能力的影响（结晶紫染色，×200；±s，n=3）Figure 5 Effect of tetrandrine on the metastasis ability of B16 cells（Crystal violet staining，×200；±s，n=3）

3.3 粉防己碱对B16 细胞EMT 相关蛋白表达的影响结果见图6。与对照组比较，1、2、4 μmol·L-1粉防己碱组的B16 细胞Vimentin、N-cadherin 蛋白表达显著下调（P＜0.01，P＜0.001），E-cadherin 蛋白表达显著上调（P＜0.01，P＜0.001）。结果表明，粉防己碱能够抑制黑色素瘤B16细胞的EMT进程。

图6 粉防己碱（Tet）对B16 细胞上皮间质转化相关蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 6 Effects of tetrandrine on the expression of EMT-related proteins in B16 cells（±s，n=3）

3.4 粉防己碱对黑色素瘤肺转移模型小鼠的影响结果见图7。与模型对照组比较，粉防己碱高剂量组小鼠的黑色素瘤肺转移结节数量明显减少（P＜0.05）。结果表明，粉防己碱能够抑制小鼠黑色素瘤的肺转移。

图7 粉防己碱（Tet）抑制小鼠黑色素瘤肺转移的情况（±s，n=6）Figure 7 Effect of tetrandrine on lung metastasis of melanoma in mice（±s，n=6）

3.5 网络药理学分析将粉防己碱作用靶点与黑色素瘤疾病相关靶点取交集，共得到60 个潜在作用靶点。利用STRING 数据库进行交集靶点的PPI 分析，并将结果导入Cytoscape 3.7.1 软件构建PPI 网络，结果见图8。图中节点的大小、颜色与Degree值呈正相关，Degree 值越大，节点越大、颜色越深。进一步筛选出TNF、RELA、CHUK、ATM、BCL2、IL1B、ICAM1、NFKBIA、AKT1、PRKAA1、CDKN1B、CCND1、CDKN1A、COL2A1、FOXO3、CASP9、CREBBP 等核心靶点，其中AKT1为相互作用最强的靶点，可能是粉防己碱治疗黑色素瘤的关键靶点。

图8 粉防己碱治疗黑色素瘤潜在作用靶点的PPI 网络Figure 8 PPI network of potential targets of tetrandrine in the treatment of melanoma

GO 功能富集分析结果见图9，BP 条目主要涉及I-κB激酶/NF-κB信号传导、蛋白质磷酸化的正向调节、细胞凋亡的过程等；CC 条目主要涉及细胞质、胞浆、线粒体外膜等；MF 条目主要涉及蛋白质结合、乙酰胆碱受体活性、蛋白激酶结合等。KEGG通路富集分析结果见图10，主要涉及细胞凋亡、FoxO、TNF、PI3K-AKT、NF-κB等信号通路。

图9 粉防己碱治疗黑色素瘤潜在作用靶点的GO 功能富集分析Figure 9 GO enrichment analysis of potential targets of tetrandrine in the treatment of melanoma

图10 粉防己碱治疗黑色素瘤潜在作用靶点的KEGG 通路富集分析Figure 10 KEGG pathway enrichment analysis of potential targets of tetrandrine in the treatment of melanoma

3.6 分子对接验证选择“3.5”项下筛选得到的TNF、NFKBIA、RELA、AKT1、CCND1 等核心靶点，分别与粉防己碱进行分子对接验证，结果见表1。结合能＜0 表明配体分子均能与受体蛋白自发结合，结合能绝对值＞5.0 表示结合活性比较好，结合能绝对值＞7.0 表示结合活性较强。结果表明，粉防己碱与AKT1、TNF、RELA等核心靶点均有较强的结合活性。结合PPI 网络及KEGG 通路富集分析发现，调控AKT/NF-κB 通路可能是粉防己碱抗黑色素瘤的重要作用机制之一，故通过体外实验对该结果进行了验证。

表1 核心靶点与粉防己碱的分子对接结果Table 1 Molecular docking results of core targets and tetrandrine

3.7 粉防己碱对B16 细胞AKT/NF-κB/CREB 通路相关蛋白表达的影响结果见图11 、图12 。与对照组比较，粉防己碱1、2、4 μmol·L-1组细胞的p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-CREB/CREB 蛋白表达明显下调（P＜0.05，P＜0.01），SC79 组细胞的p-AKT、p-NF-κB p65 蛋白表达显著上调（P＜0.001）。与SC79组比较，2 μmol·L-1粉防己碱+ SC79组细胞的p-AKT、p-NF-κB p65、p-CREB 蛋白表达显著下调（P＜0.001）。

图11 粉防己碱（Tet）对B16 细胞AKT/NF-κB/CREB 通路相关蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 11 Effects of tetrandrine on the protein expressions of AKT/NF-κB/CREB pathway in B16 cells（±s，n=3）

图12 粉防己碱（Tet）+AKT 激动剂（SC79）对B16 细胞p-AKT、p-NF-κB p65、p-CREB 蛋白表达的影响（±s，n=3）Figure 12 Effects of tetrandrine plus AKT agonist（SC79）on the protein expressions of p-AKT，p-NF-κB p65 and p-CREB in B16 cells（±s，n=3）

4 讨论

黑色素瘤是一种多发生于皮肤组织，具有强侵袭性的肿瘤，近年来其发生率和死亡率不断升高。天然活性成分因其安全性及生物利用度高的特点，在治疗肿瘤方面具有较大潜力。研究[3-9]发现，粉防己碱能够抑制乳腺癌、肝癌、鼻咽癌、宫颈癌、肾癌、口腔癌和前列腺癌等多种肿瘤的发生发展。其通过调控Caspase、Wnt/β-catenin、PI3K/Akt/mTOR、NF-κB、Hippo/YAP等信号通路[3，10-13]诱导肿瘤细胞凋亡、自噬，抑制增殖、迁移和侵袭，逆转多药物耐药等发挥抗肿瘤作用。然而，粉防己碱抗黑色素瘤转移的作用及机制尚未见报道。

上皮间质转化（EMT）是上皮细胞从上皮状态转换为间质状态的过程，肿瘤细胞发生EMT 时，细胞从原发部位脱落并侵入邻近组织，被认为是多数恶性肿瘤细胞发生迁移和侵袭必不可少的一个过程[14]。阻断癌细胞中的EMT 信号通路已成为一种越来越有前景的抗肿瘤策略。本研究结果表明，粉防己碱对B16细胞的增殖、侵袭和迁移能力具有显著抑制作用，并且能够明显下调B16 细胞间质指标Vimentin、N-cadherin蛋白表达，上调上皮指标E-cadherin 蛋白表达。结果表明，粉防己碱能够抑制B16细胞的EMT过程，降低其迁移和侵袭能力。进一步通过体内实验表明，粉防己碱能够明显抑制小鼠黑色素瘤肺转移。

本研究通过网络药理学分析获得60 个粉防己碱抗黑色素瘤的潜在作用靶点。进一步通过PPI网络分析显示，AKT1、TNF、CCND1、RELA、CASP9、CHUK、CREBBP 等可能是粉防己碱治疗黑色素瘤的核心靶点，其中AKT1为相互作用最强的靶点。KEGG 通路富集分析显示，潜在作用靶点主要涉及细胞凋亡、FoxO、TNF、PI3K-Akt、NF-κB 等信号通路。分子对接结果显示，粉防己碱与核心靶点均有较好的结合能力。综合分析表明，粉防己碱可能通过调控AKT/NF-κB 通路发挥抗黑色素瘤作用。有研究[15]表明，PI3K/AKT 信号通路激活可诱导NF-κB 介导的EMT 并促进肿瘤细胞转移。AKT 信号通路在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，其活化可调节多种生理生化反应，如细胞的生长增殖、凋亡、自噬等[16]。核转录因子κB（NF-κB）可调控肿瘤细胞的EMT，NF-κB p65 的核转位可诱导多个参与EMT 的基因转录[17-18]。cAMP 反应元件结合蛋白（Cyclic-AMP response binding protein，CREB）是一种转录增强因子，调控其下游靶基因介导细胞凋亡、细胞周期、DNA 损伤修复、神经元再生等细胞功能。研究[19-21]表明，其可通过调节基质金属蛋白酶表达进而影响肿瘤EMT，发挥抑制黑色素瘤、肾癌、口腔癌等肿瘤转移的作用。本研究通过体外实验表明，粉防己碱干预后黑色素瘤细胞p-AKT/AKT、p-NF-κB p65/NF-κB p65、p-CREB/CREB 蛋白表达显著下调；回复实验使用AKT 激动剂（SC79）能够上调黑色素瘤细胞p-AKT、p-NF-κB p65 蛋白表达，而粉防己碱可以逆转上述作用。结果表明，粉防己碱可能通过调控AKT/NF-κB/CREB 通路逆转EMT 进程，从而抑制黑色素瘤的恶性行为。目前的AKT 抑制剂存在严重不良反应[22]，而粉防己碱毒性较小，有研究[23]报道其可减少白血病患者放化疗的不良反应发生。粉防己碱可能具备作为AKT 抑制剂或黑色素瘤放化疗辅助药物的潜力，值得深入研究。

综上所述，粉防己碱可能通过调控AKT/NF-κB/CREB通路抑制小鼠黑色素瘤的增殖、迁移、侵袭及EMT，进而抑制小鼠黑色素瘤肺转移。后续将需要对粉防己碱抗黑色素瘤作用进行更加全面的药理学、毒理学及药代动力学方面的研究，以深入探讨其作为防治黑色素瘤药物的潜力。