养宠人群不同材质衣物微生物多样性研究

熊明 赵贞尧 李婷 谢九艳 葛媛媛 张晶晶 杨啸 曹运奕 袁帅 庞玲玲 姚粟

关键词：养宠人群，高通量测序，可培养技术，微生物多样性

0 引言

随着饲养宠物成为一种十分普遍的家庭生活方式，饲宠卫生问题受到广大养宠人关注。衣物作为宠物和养宠人互动接触的重要媒介，可为微生物生长定植提供适宜环境，促使微生物在衣物—养宠人—宠物间的传递转移。部分微生物可能对养宠人或宠物健康产生不良影响，如导致异味、使衣物受损甚至引起皮肤感染等[1-2]。

微生物在纺织品上的定植过程主要包括粘附、增殖和形成生物膜三个阶段[3]。Callewaer t、Sterndorff等人[4-5]的研究证实衣物的微生物群落组成可能与衣物材质、外界环境、穿着者皮肤、洗涤方式等因素直接相关。其中，材质成分差异导致的衣物理化性质不同，可能是影响微生物在衣物定植的关键因素。天然纤维主要由植物源纤维素和动物源蛋白质组成。棉、羊毛、丝绸等常见天然纤维织成的衣物自带的天然营养物质及吸附汗液、皮脂，均为微生物定植提供良好条件[6]。尽管材质对衣物微生物影响已有大量研究，但针对特定人群，尤其是养宠人群，其衣物材质对微生物群落结构特征的影响仍不清晰。

为解析材质对养宠人群衣物微生物群落结构特征的影响，本研究拟通过高通量测序技术及传统的分离培养法，探究棉、羊毛、丝绸材质衣物中微生物种类及其分布规律。为后续纺织、日化、洗护家电等行业的抗菌技术实现专业化、细分化升级奠定基础，同时为保障特定人群健康、构建家庭环境健康微生态环境提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 样品信息

本研究分别于2022年4月—6月开展样品采集工作，选取来自南京、杭州两座城市的6位养宠人，收集其棉质、毛质、丝质居家衣物，共计18件。养宠人群特点，如调研参研者性别、饲养宠物种类、饲养宠物类型以及饲养宠物习惯等，详见表1。

1.2 试剂与仪器

生物安全柜，ESCO；隔水式培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；高速冷冻离心机，Eppendorf；P C R 仪，B i o m e t r a ；微量核酸蛋白分析仪，Biochrom；电泳仪 BIO-RAD；恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司；高压灭菌锅，HIRAYAMA；MALDI-TOF-MS仪，BRUKER；电泳仪，BIO-RAD；凝胶成像仪，BIO-RAD ；-20℃冰箱，海尔。

TSA培养基、R2A培养基均购于BD；强化梭菌培养基、MEA培养基、PDA培养基均购于北京陆桥技术股份有限公司；Dixon改良培养基购于青岛海博生物技术有限公司；QIAamp Fast DNA StoolMini Kit购于QIAGEN；真菌DNA提取试剂盒（美国Omega Bio-Tek公司）；PCR引物，合成于生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR MasterMix DL 2000Marker购于北京全式金生物技术有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品制备

根据文献调研，选择衣物与皮肤、外环境常接触的领口、袖口、腋下作为采样位点。参考《纺织品微生物检测技术》[7]，选择称量法处理并制备待测样品，具体步骤为：收集养宠人衣物样品，用无菌剪刀在领口、袖口、腋下均匀剪下并准确称取25 g衣物样品，剪碎后加入到盛有225 mL的无菌生理盐水的均质袋中，用拍击式振荡器拍打1～2 min，充分混匀，获得1∶10的样品稀释液。

1.3.2 分离培养方法

将1∶10的样品稀释液逐级梯度稀释，制成1∶100、1∶1000的稀释液。好氧细菌的分离培养：吸取三种稀释梯度的稀释液分别于TSA培养基平板、R2A培养基平板，均匀涂布，置于30℃和37℃下好氧培养2～3天；厌氧细菌的分离培养：吸取稀释液涂布于强化梭菌培养基平板，置于30℃下厌氧培养7天；丝状真菌及酵母菌的分离培养：将三种稀释梯度的稀释液分别涂布于PDA、MEA平板，置于20℃和28℃好氧培养3～7天，将稀释液分别涂布于Dixon培养基平板，30℃好氧培养3～7天。培养过程中连续观察，选取菌落形态不相同的菌株进行分离纯化，记录其形态特征。将选取的单菌落通过平板划线法进行纯化，得到单菌落后再次通过平板划线法进行分离纯化。

1.3.3 菌种鉴定

采用MALDI-TOF MS对细菌菌株进行初步鉴定。挑取纯菌菌体并在300 μL超纯水中混匀，向混匀的菌液中添加900 μL无水乙醇并充分振蕩，离心去上清，加入50 μL 70% 甲醇重悬菌体，加入50μL乙腈并反复吹打，混匀悬液；将制备的悬液按照MALDI-TOF MS 检测规程进行鉴定分析，以确定菌株分类学地位。结果得分为2.00～3.00，表示菌株可鉴定至种水平；结果得分为1.70～1.99，表示菌株可鉴定至属水平；结果得分低于1.69，表示鉴定结果不可信。

对于无法通过M A L DI-T OF MS方法得到可信鉴定结果的细菌菌株，提取细菌菌株的基因组DNA，采用细通用引物27F/1492R 扩增细菌的16SrDNA。PCR反应条件：94℃，5 min，1 cycle；94℃，1 min；55℃，1 min；72℃，1.5 min，30 cycles；72℃，10min，1 cycle，得到的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。根据测序结果，将菌株的16S rRNA基因序列测序结果上传至EzBioCloud服务器（www.ezbiocloud.net/identify）进行相似性搜索，与已发表的有效模式菌株进行比较，确定菌株的分类学地位。

对于真菌菌株，提取真菌菌株的基因组DNA，分别采用分子标记引物对丝状真菌和酵母菌的核酸序列进行PCR扩增，丝状真菌采用引物TIS5/ITS4，酵母菌采用引物NL1/NL4。PCR反应条件：95℃ 5min；95℃ 30 s，55℃（TIS5/ITS4）或53℃（酵母菌）45 s，72℃ 45 s，共27个循环；72℃ 10 min。得到的PCR产物送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。根据测序结果，用菌株的26S rDNA和ITS基因作为靶序列，在GenBank数据库中用BLAST程序搜索同源序列，挑选与靶序列最相近的参考菌株系列进行比较，获得菌株的分类学地位。

1.3.4 样品基因组提取与高通量测序

利用QIAamp DNA提取试剂盒，提取衣物样品种的宏基因组DNA。以质检合格的宏基因组DNA为模板，使用16S rRNA基因V3/V4区和ITS基因的I T S1区通用引物进行PCR扩增。PCR扩增体系：5×FastPfu 缓冲液 8 μL，2.5 mmol/L dNTPs4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各 2 μL，FastPfu 酶 1 μL，DNA 30 ng，ddH2O 补足至 40 μL。PCR 反应条件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 45 s，72℃ 45 s，共27个循环；72℃ 10 min。使用 Agencourt AMPure XP 磁珠对 PCR 扩增产物进行纯化并溶于洗脱缓冲液中，完成文库的构建。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 对构建文库的片段范围及浓度进行检测，检测合格的文库利用 HiSeq2500 平台进行扩增子测序。

1.3.5 高通量测序结果分析

数据分析主要包括测序数据过滤、Tag拼接、OTU聚类、物种注释和物种复杂度分析等流程。利用QIIME 2的DADA2方法对下机数据进行质控，去除低质量序列、嵌合体并得到Clean Data。使用软件 FLASH（Fast Length Adjustment of Short reads，v1.2.11），利用重叠关系将双末端测序得到的成对Reads 组装成一条序列，得到高变区的Tags。利用软件USEARCH（v7 .0.1090）将拼接好的Tags聚类为OTU，并采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU 代表序列进行分类学分析，并在界、门、纲、目、科、属和种水平统计分析各样本的群落组成。利用QIIME2中q2-diversity方法进行Alpha多样性分析，chao指数、shannon指数共同表征样品的 Alpha 多样性。

2 结果与分析

2.1 养宠人群衣物样品α多样性指数分析

Alpha多样性指数用于估计特定生态系统内物种多样性，通常包括Chao1、ace、shannon、simpson和coverage指数。其中，以Chao1指数评估样品物种总数，指数值越大，表示样品物种丰富度越高。以shannon指数评估物种多样性，shannon指数越大，表示样品物种多样性越高。

综合上述两项指数，分析养宠人群衣物微生物群落结构。细菌方面，如图1A所示，棉质样品Chao1指数平均值为757.4，高于丝质样品（平均值为662.0）和毛质样品（平均值为492.4），棉质样品具有较高的细菌物种总数；如图1B所示，丝质样品Shannon指数平均值为3.56，高于毛质样品（平均值为3.25）和棉质样品（平均值为2.40），丝质样品具有较高的细菌物种多样性。真菌方面，如图1C所示，毛质样品Chao1指数平均值为353.2，高于棉质样品（平均值为296.5）和丝质样品（平均值为186.9），毛质样品具有较高的真菌物种总数；如图1D所示，毛织样品Shannon指数平均值为3.95，高于棉质样品（平均值为3.84）和丝质样品（平均值为3.50），毛质样品具有较高的真菌物种多样性。

2.2 养宠人群衣物样品微生物聚类分析

Beta多样性用于比较不同组别样品之间的多样性，是衡量不同组别样品间微生物组成相似度的指标。如图2A所示，衣物细菌样品在PCA图中整体较为分散，棉质衣物样品中C1、C2、C3、C4分布位置较为集中，毛质、丝质衣物样品在图中分布较为分散，不同材质衣物细菌的β多样性没有显著性差异；如图2B所示，部分衣物真菌样品在PCA图中较为集中，棉质衣物样品C4、C5，丝质衣物样品S1、S3、S4、S6分布位置较为集中，其余样品在图中分布较为分散，不同材质衣物真菌的Beta多样性没有显著性差异。

2.3 养宠人群衣物样品微生物组成及丰度分析

进一步分析养宠人群衣物样品的细菌组成及相对丰度。在门水平上，变形菌门（Proteobacteria）是三类材质衣物样品中的绝对优势菌门，在三类材质衣物中占比分别73.1%、65.9%、51.7%。此外，厚壁菌门（Firmicutes）、放线菌门（Actinobacteria）及拟杆菌门（Bacteroidetes）也是三类衣物中的优势菌门。在属水平上，统计相对丰度超过1%的细菌菌属。棉质衣物样品中优势细菌菌属为水栖杆菌属（Enhydrobacter），其相对丰度达到47.2%，值得注意的是，對比序列相似性能够发现，属水平鉴定为水栖杆菌属（Enhydrobacter）的OTU与奥斯陆莫拉菌（Moraxella osloensis）呈现100%的序列相似性。Yan等人[8]发现水栖杆菌属（Enhydrobacter）在棉质衣物中检出的相对丰度高于聚酯和混纺衣物，由此推测水栖杆菌属（Enhydrobacter）在棉质衣物中可能具有较强的定植能力；马赛菌属（Massilia）、不动杆菌属（A c i n e t o b a c t e r）及卟啉单胞菌属（Porphyromonas）是毛质衣物样品中的优势细菌菌属，相对丰度分别为16.3%、14.0%、7.7%；丝质衣物样品中不动杆菌属（Acinetobacter）和葡萄球菌属（Staphylococcus）是部分样品的优势细菌菌属，相对丰度分别为18.1%和5.2%。

分析养宠人群衣物样品的真菌组成及相对丰度。在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）在三类材质衣物中的占比分别为39.1%、53.8%、59.7%，担子菌门（Basidiomycota）在三类材质衣物中的占比分别为60.0%、43.4%、38.9%，上述两菌门为衣物样品中的绝对优势菌门。在属水平上，统计相对丰度超过1%的真菌菌属。棉质衣物样品优势菌为节担菌属（Wallemia）、马拉色氏菌属（Malassezia）、枝孢霉属（Cladosporium），其相对丰度分别在27.1%、11.8%、11.0%之间；毛质衣物样品优势菌属为曲霉属（Aspergillus）、节担菌属（Wallemia），其相对丰度分别在18.9%、15.9%；丝质衣物样品优势菌属为曲霉属（Aspergillus）、马拉色氏菌属（Malassezia）、枝孢霉属（C l a do sp or iu m），其相对丰度分别在19.8%、12.1%、10.8%。

2.4 养宠人群衣物样品可培养微生物分析

通过可培养方法探究养宠人群衣物中微生物多样性，在属水平上统计三组样品微生物分离种类及数量。本研究共从18件衣物样品中分离获得172株微生物，其中细菌123株，涵盖25个属。在这123株细菌中，从棉质衣物中分离获得45株细菌，分属于15个属；从毛质衣物中分离获得40株细菌，分属于14个属；从丝质衣物中分离获得38株细菌，分属于12个属。

在属水平上，棉质衣物分离频次较高的菌属主要是芽胞杆菌属（B a c i l l u s）、葡萄球菌属（S t a p hylo c o c cu s）；毛质衣物分离频次较高的菌属主要是葡萄球菌属（S t a p hylo c o c c u s）、芽胞杆菌属（Bacillus）、马赛菌属（Massillia）；丝质衣物分离频次较高的菌属主要是葡萄球菌属（Staphylococcus）、芽胞杆菌属（Bacillus）、考克氏菌属（Kocuria）。其中，芽胞杆菌属（Bacillus）、马赛菌属（Massillia）是常见环境菌属，葡萄球菌属（Staphylococcus）、考克氏菌属（Kocuria）则为人与宠物皮肤常驻菌属。

在种水平上，一共有4 9株细菌鉴定至种水平。棉质衣物分离频次较高的菌种主要是人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）；毛质衣物分离频次较高的菌种主要是人葡萄球菌（Staphylococcushominis）、沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri）、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）；丝质衣物分离频次较高的菌种主要是人葡萄球菌（Staphylococcushominis）、印度考克氏菌（Kocuria indica）。其中，人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）广泛分布于三类衣物样品中，是人类皮肤常驻菌种，通常在腋窝微生物群中丰度较高。

真菌分离获得49株，涵盖25个属。其中从棉质衣物中分离获得27株真菌，分属于15个属；从毛质衣物中分离获得14株真菌，分属于10个属；从丝质衣物中分离获得8株真菌，分属于7个属。

在属水平上，棉质衣物分离頻次较高的菌属主要是曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、短梗霉属（Aureobasidium）；毛质衣物分离频次较高的菌属主要是枝孢霉属（Cladosporium）；丝质衣物种无分离频次较高的菌属。其中，短梗霉属（Aureobasidium）在自然条件下主要分布于植物的茎、叶、花、果实表面，岩石表面和沿海水域，也从亚麻质衣物中分离获得过曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、枝孢霉属（Cladosporium）从自然环境、人体皮肤、宠物皮肤中有分离报道。

3 讨论

本研究收集棉、毛、丝质衣物样品，通过高通量测序及传统培养法分析材质差异对养宠人衣物微生物产生的影响。高通量测序结果显示，材质对衣物微生物群落结构没有显著性影响，但水栖杆菌属（Enhydrobacter）、葡萄球菌属等部分菌属（Staphylococcus）在不同材质中的分布存在差异；通过传统培养法，共收集获得172株微生物，其中细菌123株，真菌49株。

衣物微生物受到穿着者影响，人类皮肤微生物群落可能直接影响衣物的微生物群落结构，Y a n 等人[ 8 ]研究结果表明，水栖杆菌属（Enhydrobacter）、微球菌属（Micrococci）、丙酸杆菌属（Propionibacterium）等皮肤常驻菌也是衣物中的高频检出菌种。本研究中棉、毛、丝质衣物作为天然纤维织物均具有较好的保水性，微生物易通过代谢人类皮脂、汗液定植于织物中。高通量测序结果显示，在门水平上三类衣物微生物群落结构相似，变形菌门（Proteobacteria）是绝对优势细菌菌门，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是绝对优势真菌菌门。相似的微生物群落结构可能与样品采集部位有关。本研究采集衣物的领口、腋下、袖口等部位，腋窝贴近衣物的腋下和袖口部位属于皮肤潮湿区，变形菌门（Proteobacteria）在该区域占据绝对优势[9]，变形菌门（Proteobacteria）也是宠物猫、宠物狗皮肤中的常驻菌，广泛分布于宠物猫、宠物狗的口腔、鼻孔、腋下、爪等部位[10- 11]。此外，子囊菌门（Ascomycota）、担子菌门（Basidiomycota）是人类和宠物猫狗皮肤常驻真菌[12-14]。此前有研究显示，饲养宠物可能为家庭成员引入更多的外源微生物，相对而言养狗的成年人皮肤细菌群落种类更加丰富[15]。宠物与养宠人的微生物群可能存在交互共享，衣物可能作为中间媒介参与了微生物的交互传递过程，衣物微生物群落构成可能与两者的微生物群密切相关。

衣物材质不同可能导致微生物群落组成出现差异。棉质织物主要由植物纤维组成，其中纤维素占比在9 0%以上，部分微生物通过外葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶等生物酶将纤维素逐级分解，纤维素降解可能导致纤维结构断裂、机械强度下降[5]。细菌方面，水栖杆菌属（Enhydrobacter）作为人体皮肤常驻细菌在棉质衣物中高丰度检出，该菌属可能通过内切葡萄糖酶推动纤维素的糖化及利用过程[16]，这可能是其在棉质衣物中高丰度定植的关键因素。其属下的奥斯陆莫拉菌（Moraxella osloensis）在中国人群皮肤中高丰度富集，并在洗衣机、晾晒后衣物等人类相关环境中检出。Kubota等[17]人推测可能产生4-甲基-3-己烯酸（4-methyl-3-hexenoic acid，4M3H）导致晾晒后衣物出现“湿抹布般的臭味”。副球菌属（Paracoccus）在棉质衣物中检出丰度较高，该细菌菌属广泛分离于水、土壤、污泥等自然环境中。Jacksch等人[18]也发现副球菌属具有在洗衣机中长期定植的潜力。副球菌属（Paracoccus）通常被认为是纤维素降解模式菌，常用于农业废弃物降解[19]，其高效的纤维素水解能力可能是其在棉质衣物上高丰度定植的关键。真菌方面，节担菌属（Wallemia）是棉质衣物中检出丰度最高的真菌菌属，该菌属在家庭空气、家庭灰尘中广泛分布。Yin等人[20]的研究证实节担菌属（Wallemia）可能通过高活性的纤维素酶促使纤维素降解并转化为有机物，这可能有利于其在棉质织物真菌群落中占据优势。

毛质织物和丝质织物主要由角蛋白组成，部分微生物通过角蛋白水解酶水解蛋白结构中的二硫键，从而导致羊毛或蚕丝劣化[21]。细菌方面，马赛菌属（Massilia）在羊毛衣物中被高频检出。作为常见环境菌属，马赛菌属（Massilia）常分布于水、土壤、岩石表层、空气中。Michela等人[22]的研究证实，绵羊毛处理残留物作为改良剂可能提高土壤中马赛菌属（Massilia）的丰度，证明潜在的羊毛纤维利用能力可能使其成为羊毛织物中的优势细菌。葡萄球菌属（Staphylococcus）在丝质衣物中被高频检出。作为人体皮肤常驻菌，葡萄球菌属（Staphylococcus）在不同粒径规格的丝素蛋白处理下具有较高的存活率[23]，推测葡萄球菌（Staphylococcus）可能通过角蛋白酶降解并利用丝素蛋白。真菌方面，相较棉质织物，马拉色氏菌属（Malassezia）在毛质和丝质织物中丰度较高，作为人类、宠物皮肤常驻菌，除附着在衣物上的皮脂成分，羊毛和蚕丝中角蛋白基质可能为马拉色氏菌属（Malassezia）在织物中的高丰度提供适宜的底物[24]。

结合养宠人群衣物生境特点，综合分析衣物样品中微生物群落结构特点和分离菌株特性，重点关注衣物中具有潜在致病、致异味特性的菌株。参考《人间传染病目录》筛选潜在条件致病菌，本研究中分离获得的具有潜在致病特性的条件致病菌，包括蜡样芽胞杆菌（Bacillus cereus）[25]、表皮葡萄球菌（Staphylococcusepidermidis）、人葡萄球菌（Staphylococcus hominis）、曲霉属（Aspergillus）[26]、枝孢霉属（Cladosporium）[27]等；人体、衣物异味可能是由于部分微生物降解人体皮脂、汗液代谢产生的挥发性有机化合物（VOCs）导致，如异戊二酸、乙酸、4-甲基-3己烯酸等[17， 28]。在本研究中，分离获得的具有潜在致异味特性的关键菌属包括，表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）、奥斯陆莫拉氏菌（Moraxella osloensis）[17， 29]、藤黄微球菌（Micrococcus luteus）[28]等。

4 结论

本研究针对养宠人群不同材质衣物微生物群落结构开展调研分析。高通量测序结果显示，衣物材质差异不会对养宠人群衣物的微生物物种总数和多样性产生显著性影响，变形菌门（Proteobacteria）是三类材质衣物样品中的绝对优势细菌菌门，子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）是三类材质衣物中的绝对优势真菌菌门；培养法共分离获得172株微生物菌种，包括来自25个属的细菌123株，25个属的真菌49株。本研究首次通过高通量测序技术和培养法全面解析养宠人群不同材质衣物微生物特征，分离获得关键微生物菌种资源，为后续抗菌织物的开发及衣物健康洗护研究奠定了基礎。