高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）同时测定精酿啤酒中嘌呤类物质含量的研究

李 萍，贾春晓，宁方尧，温 韬，陈 延

（1.广西工业职业技术学院，广西南宁 530004；2.广西壮族自治区产品质量检验研究院，广西南宁 530004）

啤酒以麦芽为主要原料经酵母发酵而成，富含 多种营养物质（如维生素、矿物质、碳水化合物、氨基酸和酚类化合物），也被称为液体面包，是世界上消费最广泛和最受欢迎的酒精饮料[1]，是居民饮食的重要组成部分。与其他酒精饮料相比，啤酒中的嘌呤含量相对较高，为40～136 mg/L[2]。高嘌呤食品在体内代谢变化容易导致人血液中尿酸含量增高，形成高尿酸血症、痛风、高血压、糖尿病等多种代谢慢性疾病[3]。研究表明，啤酒的长期饮用是引起高尿酸血症[4]的重要原因，啤酒与痛风[5]之间存在高度依赖性。精酿啤酒作为高端啤酒市场的主要代表，是一种具有独特风味和酿造方式的个性化啤酒产品。近年来，我国精酿啤酒的销量以每年40%的速度增长，很受消费者欢迎。因此，精酿啤酒中嘌呤的准确检测具有重要意义，可为精酿啤酒的生产和消费提供科学指导。

目前，国内外对啤酒中嘌呤的含量尚无精确、统一的测定方法。嘌呤主要以结合态形式存在于啤酒中，为了测定啤酒中的嘌呤含量，应先水解4种嘌呤碱。嘌呤含量的主要检测方法包括高效液相色谱、气相色谱、反相离子对色谱、液相色谱-串联质谱和毛细管电泳[6-7]。其中，高效液相色谱（HPLC）是最常用的检测啤酒等酒精饮料中4 种嘌呤的方法[8-9]。青岛大学医学院医学营养研究所[10]建立了测定啤酒4 种嘌呤的高效液相色谱法，测得腺嘌呤25.95 mg/L、鸟嘌呤21.60 mg/L、次黄嘌呤435 mg/L，回收率分别为95.8 %、91.3 %、90.6 %和91.3%；江南大学[11]研究了反相离子对色谱法测定市售普通啤酒中4 种嘌呤的方法，方法的精密度为1.41 %～2.42 %，4 种嘌呤物质的回收率为91.2%～100.3%。由于嘌呤属弱碱性物质，在液相色谱柱中的分离度差，仅依靠紫外检测器的保留时间定性，会存在区分准确度低的问题。

本研究通过液相色谱串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测了6 种市售精酿啤酒中的鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤和次黄嘌呤4 种嘌呤物质的含量。在探究样品前处理条件的基础上，通过实验筛选适用于精酿啤酒嘌呤检测的流动相种类、pH 值等色谱检测条件，建立HPLC-MS/MS 测定精酿啤酒中嘌呤类物质含量的方法，为开发低嘌呤精酿啤酒提供可靠的检测方法和研究思路，以指导痛风病人的健康膳食，同时为食品安全生产提供实验数据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

酒样：6款精酿啤酒样品（市售）。

试剂及耗材：腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤标准品（纯度＞98.0%），中国药品生物制品检定所；甲醇（色谱纯），美国Honeywell公司；甲酸、三氟乙酸、高氯酸、磷酸、盐酸、硫酸（色谱纯），阿拉丁试剂（上海）有限公司；试验用水为超纯水。

仪器设备：Agilent 1290 6460A 超高效液相色谱串联三重四极杆质谱仪，美国Agilent 公司；Milli-Q超纯水机，美国Millipore公司。

1.2 试验方法

1.2.1 嘌呤标准溶液的制备

将适量的腺嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤和次黄嘌呤标准品，分别置于刻度试管中，超声溶解，制备浓度约1000 mg/L 的标准储备溶液，在4 ℃下保存。取适量的4 种标准储备溶液按5 μg/L、10 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、250 μg/L、500 μg/L 的浓度梯度依次稀释，4 ℃下保存备用。

1.2.2 样品中嘌呤酸法提取条件的优化

将啤酒样品进行超声脱气，1.0 mL 样品放入10 mL 带塞子的试管中，加入适量的酸溶液，摇匀，置于一定温度下，水解一段时间后取出，冷却至室温。将pH 值调整为中性，定容，过0.22 μm 滤膜，保存以进行分析。

酸种类的筛选：分别采用三氟乙酸与甲酸（1∶1）混合液、高氯酸、盐酸、磷酸、硫酸5 种酸溶液对样品进行酸水解，水解结束后保存以分析嘌呤总含量。

嘌呤提取工艺的单因素试验：分别往样品中加入3 mL、4 mL、5 mL、6 mL、7 mL 酸溶液，摇匀，分别置于80 ℃、85 ℃、90 ℃、95 ℃、100 ℃下，水解0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h，水解结束后保存以分析嘌呤总含量。

嘌呤提取工艺的响应面实验：酸种类及其最佳条件通过单因素实验确定后，以嘌呤总含量为响应值，使用Box-Behnken 设计方法设计响应面法，采用Design expert 8 软件进行数据处理和回归分析[12]。研究了酸处理条件对总嘌呤含量的影响，探索最佳工艺条件。

1.2.3 液相色谱条件优化

将水解后的样品，使用液相色谱仪进行分离。采用Shim-pack GIST C18（2.1 mm×100 mm，2.0 μm）[13]色谱柱。在该色谱柱上，考察流动相种类（甲醇-含0.1 %甲酸和0.5 mmol/L 乙酸铵水溶液、甲醇-0.5 mmol/L 乙酸铵水溶液、甲醇-水）和pH 值（3.2、3.4、3.6、3.8、4.0、4.2）对分离效果的影响，流速0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量20 μL。

1.2.4 质谱条件[14]

离子源：电喷雾离子源（ESI）。扫描模式：正离子模式。检测模式：多反应监测（MRM）。离子源参数：雾化器流量3.0 L/min，加热器流量10.0 L/min，接口温度300 ℃，脱溶剂温度250 ℃，DL 温度250 ℃，加热块温度400 ℃，干燥器流量10 L/min。

1.2.5 方法学验证

测试嘌呤标准溶液，用峰面积(Y)和样品浓度(X)进行线性回归。将4 种嘌呤标准溶液稀释到不同浓度，上机检测，以相应浓度为3 倍信噪比(S/N)的检测限(LOD)。根据所建立的方法，以10 μL 的注射量，将相同的混合标准剂连续注射6 次，测定方法的精密度(RSD)。

1.2.6 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 2.0 软件对数据进行单因素方差分析以及最小显著差数法统计学显著性分析（P＜0.05），，采用Origin8.5绘图。

2 结果与分析

2.1 酸种类的选择

本研究分别考察了精酿啤酒经过三氟乙酸与甲酸（1∶1）混合液、高氯酸、盐酸、磷酸、硫酸5 种酸溶液处理后的总嘌呤含量。如图1 所示，采用三氟乙酸与甲酸（1∶1）混合液处理后，总嘌呤的含量高于其他4 种酸溶液，这说明经过三氟乙酸与甲酸（1∶1）混合液水解后，样品中嘌呤损失小，与林钦恒研究结果一致[15]。研究表明[16]，高浓度的高氯酸会降解嘌呤，磷酸只能提取鸟嘌呤和腺嘌呤，盐酸处理会对嘌呤造成损伤。因此，采用三氟乙酸与甲酸（1∶1）混合液作为精酿啤酒的酸处理溶液。

图1 酸的种类对总嘌呤含量的影响

2.2 嘌呤提取工艺的单因素实验

选择三氟乙酸与甲酸（1∶1）混合液对啤酒中的总嘌呤类物质进行提取。嘌呤水解时具有不稳定性，为了使其既能被充分水解而又不会被水解过度，需要对水解条件进行优化。研究表明[17]，酸的用量、水解时间和水解温度对嘌呤提取有显著影响。如图2A 所示，总嘌呤含量随着料液比的增加而增加，在1∶5 时达到最高，然后趋于稳定，因此，添加的酸的量是样品体积的5 倍。水解时间对总嘌呤含量的影响如图2B 所示，随着水解时间的延长，样品中总嘌呤含量先升高后降低，这可能是由于水解时间过长时嘌呤过度水解，导致总含量降低。当水解时间为1 h 时总嘌呤含量最高，因此精酿啤酒的水解时间选择为1 h。水解温度对总嘌呤含量的影响如图2C 所示，样品中总嘌呤含量随着水解温度的增加而升高，并于95 ℃时达到最高，之后略有下降，可能是由于一些嘌呤碱在高温下会被破坏。

图2 水解条件对总嘌呤含量的影响

2.3 嘌呤提取工艺的响应面实验

根据单因素实验结果，选取A-料液比为1∶5、B-水解温度95 ℃、C-水解时间为1 h，采用Box-Behnken 设计三因素三水平响应面实验，对各因素水平进行编码，并以Y-总嘌呤含量作为响应值。设计试验因素及水平见表1，结果见表2。采用Design-Expert 8 软件对表2 中的数据进行极性多元回归拟合，得到以总嘌呤含量为响应值的二次回归方程模型：

表1 Box-Behnken设计的因素和水平

表2 响应面实验设计及结果

Y-总嘌呤=95.77+10.59*A+1.46*B+7.27*C+0.53*A*C+1.42*B*C-23.67*A2-2.93*B2-13.81*C2+2.86*A2*B-1.09*A*B2-5.13*A*C2

回归方程的方差分析如表3 所示，相关系数R2为0.9112，说明嘌呤总含量的二次回归方程与实验结果吻合较好；模型的P 值（＜0.0001）远小于0.01，说明响应回归模型已经达到了极显著的水平；失拟项P=0.0694＞0.05，差异不显著，说明方程拟合良好，实验误差较小；该模型的校正系数R2为0.9975，表明方程拟合程度较好；模型的修正系数RAdj2=0.9906 表明该模型可以很好地反映总嘌呤含量的关系。

表3 以总嘌呤含量为响应值的回归方程方差分析表

在该模型中，A-料液比、B-水解温度和C-水解时间极显著影响总嘌呤含量（P＜0.01）；二次项A2、B2和C2极显著影响总嘌呤含量（P＜0.01）；AB显著影响总嘌呤含量（P＜0.05），AC 和BC 对总嘌呤含量的影响不显著（P＞0.05）。各因素对总嘌呤含量的影响显著情况：A-料液比＞C-水解时间＞B-水解温度。

图3 为由Design Expert 8 软件绘制的三组因素交互作用的响应面曲面和等高线。响应面图越陡，两个因素对响应值的交互作用就越明显，反之不明显。从图3 中可以看出，交互项中A-料液比和B-水解温度引起总嘌呤含量变化幅度较大，表明二者交互作用对总嘌呤含量影响显著；A-料液比和C-水解时间、B-水解温度和C-水解时间的交互作用引起总嘌呤含量变化幅度较小，表明二者交互作用对总嘌呤含量影响不显著。根据响应面优化结果，得到酸水解的最佳条件为料液比1∶5.22(v/v)、温度89.04 ℃、水解时间1.2 h。在此条件下，总嘌呤含量最大值为97.64 μg/L，优化后的总嘌呤含量为96.77 μg/L，与模型预测值接近，较优化前提高了近12%，说明回归方程能准确反映各因素对嘌呤总含量的影响。

图3 三因素交互作用对总嘌呤含量影响的响应面结果图

2.4 色谱条件的优化

采用高效液相色谱法（HPLC）分离了混标中的4 个嘌呤，本研究探索了不同流动相类型和流动相的pH 值对分离效应的影响。如表4 所示，在不同种类的流动相条件下，混标经过色谱柱后，从左到右依次为腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤、黄嘌呤。与甲醇-水流动相体系相比，腺嘌呤和鸟嘌呤在甲醇-0.1 %甲酸、0.5 mM 乙酸铵和甲醇-0.5 mM 乙酸钠流动相体系中的保留时间相对接近，难以完全分离。甲醇可以调节体系的极性，改变嘌呤与流动相的结合能力，破坏嘌呤物质和配体基团的亲和力，增加流动相的洗脱强度，从而提高分离精度[18]。

表4 不同流动相种类下4种嘌呤的保留时间 (min)

嘌呤属于生物碱，均具有弱碱性，流动相的pH值对4 种嘌呤的分离效果影响较大。如表5 所示，采用甲醇-水作为流动相，分别在pH 值为3.4、3.6、3.8、4.0、4.2的条件下考察4种嘌呤的分离效果。当pH4.0 时，分离效果较佳，因此，选择pH4.0 作为色谱分离条件。

表5 不同pH下的嘌呤保留时间 (min)

2.6 标准曲线

将配制好的4 种嘌呤的混合标准溶液在优化后的色谱条件下依次进样，在正离子检测模式下进行电离和一级质谱扫描，得到不同浓度的混标溶液总离子流图，见图4。4 种嘌呤分离度良好，响应灵敏，出峰顺序和保留时间分别为腺嘌呤0.852 min、鸟嘌呤0.969 min、次黄嘌呤1.334 min、黄嘌呤1.598 min。以标准品的质量浓度（X，μg/L）作为横坐标，定量离子峰的面积（Y）作为纵坐标，通过线性回归分析得出回归方程。如表6 所示，4 种嘌呤的线性回归方程的相关系数均在0.9998 以上，具有良好的相关性；检出限为0.08～1.5 μg/L，相比于目前常用的高效液相色谱法[19]，检测灵敏度得到了提高。

表6 4种嘌呤的标准曲线拟合情况

图4 不同浓度的嘌呤混标总离子流图

图5 市售精酿啤酒中嘌呤总离子流图

2.7 加标回收率与精密度

随机选择一种精酿啤酒进行加标回收试验，在测得样品本底值的基础上，加入相对本底值20%～100%浓度的嘌呤标准品，平行测定6 次，通过IBM SPSS Statistics 2.0 计算平均回收率和相对标准偏差（δRSD）。如表7 所示，相对标准偏差（δRSD）在0.9 %～2.4 %之间。次黄嘌呤、鸟嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤的加标回收率分别为95.38 %、87.64%、79.54%、87.50%，优化后的方法准确度符合一般检测的要求[20]。

表7 样品的加标回收率和精密度

2.8 样品含量的检测

采用优化后的HPLC-MS/MS 方法对6 种市售精酿啤酒进行4 种嘌呤含量的测定，结果见表8。6种市售精酿啤酒中的鸟嘌呤含量最高，为1.78～3.21 mg/L，次黄嘌呤为0.42～1.05 mg/L，腺嘌呤为1.01～1.50 mg/L，黄嘌呤为0.38～1.35 mg/L，总嘌呤含量均为3.57～5.68 mg/L。相比较普通啤酒的40～136 mg/L 的总嘌呤含量[21]，精酿啤酒属于低嘌呤饮料，更加安全可靠，适合中老年人饮用。

表8 市售精酿啤酒中嘌呤含量 (mg/L)

3 结论

本研究建立了HPLC-MS/MS 法同时检测精酿啤酒中4 种嘌呤含量的方法，经方法学验证，本方法完全适用于精酿啤酒中4 种嘌呤含量的测定。通过单因素和响应面实验优化了嘌呤酸水解条件，研究发现采用三氟乙酸与甲酸(1∶1)的混合物水解样品，料液比为1∶5.22(v/v)，温度为89.04 ℃，水解时长为1.2 h时，精酿啤酒总嘌呤含量最高。在pH4的甲醇-水流动相体系中，4 种嘌呤的分离效果最好，HPLC-MS/MS 法同时测定精酿啤酒中次黄嘌呤、腺嘌呤、黄嘌呤、鸟嘌呤4 种嘌呤含量最精确。该方法加标回收率大于80 %，相对标准偏差（δRSD）在0.9 %～2.4 %之间。相较HPLC 法，HPLC-MS/MS 操作方便、准确度和精密度高，并且可以一次性检测全部嘌呤类物质，是分析精酿啤酒中嘌呤类物质的理想方法。

随着人们生活质量的提高，研究安全稳定的低嘌呤食品符合当下绿色饮食的发展方向，快速、灵敏的嘌呤检测方法可为大众健康饮食提供科学依据。采用HPLC-MS/MS 法对6 种市售精酿啤酒中4 种嘌呤含量进行检测，发现市售精酿啤酒中的总嘌呤含量均为3.57～5.68 mg/L，相比较普通啤酒的40～100 mg/L 的总嘌呤含量，精酿啤酒更加安全可靠，适合中老年人饮用。