刺五加精制多糖对尼古丁诱导的学习记忆障碍小鼠的影响

邹 婷, 刘友昊, 高晓岩, 邓代千, 吴宜艳

(1. 牡丹江医学院, 黑龙江 牡丹江, 157011; 2. 牡丹江医学院附属红旗医院, 黑龙江 牡丹江, 157011)

尼古丁主要作用于中枢系统,是导致机体对烟草上瘾和产生依赖的重要物质。尼古丁依赖是由反复吸烟导致的慢性、有强烈成瘾、易复发的一种征候群,具备显著的戒断症状[1-2]。尼古丁戒断综合征是指当机体反复摄入尼古丁形成尼古丁依赖后,终止给药后会产生一系列躯体、认知和情感障碍[3],危害身心健康。认知障碍包括难以集中注意力和记忆力退化[4],是尼古丁戒断症状的核心症状。研究[5]证明,尼古丁依赖可导致海马相关认知功能受损,因此改善尼古丁戒断个体的学习与记忆能力,可能是改善尼古丁戒断综合征的有效途径。刺五加多糖是中药刺五加的主要活性成分之一,具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化、抗疲劳等作用。研究[6]表明,纯化刺五加水溶性多糖具有高效的体外抗氧化及体外淋巴细胞增殖的免疫调节活性。实验[7]结果表明,刺五加多糖可改善小鼠脑组织中自由基引起的氧化损伤,从而提高辐射诱导小鼠的学习记忆能力。关于刺五加多糖对尼古丁诱导的学习记忆障碍报道罕见,本研究采用刺五加精制多糖(ASPS)干预治疗该病,从海马相关神经递质及机体抗氧化角度分析其作用机制,以期为临床尼古丁戒断症状寻找新的药物。

1 材料与方法

1.1 药物

尼古丁购于上海时代生物科技有限公司; 吡拉西坦购于广东华南药业集团有限公司; 刺五加浸膏购于黑龙江珍宝岛药业股份有限公司。

1.2 实验动物

选取6周龄无特殊病原体(SPF)级美国癌症研究所(ICR)小鼠96只,雌雄各半,体质量(20±2) g, 购买于牡丹江医学院医药研究中心[SCXK(黑)2019-006], 福利与伦理审查编号: IACUC-20221021-2。动物房温度控制在20～24 ℃, 饲养期间自由饮水、进食。

1.3 主要仪器与试剂

Morris水迷宫、新物体识别设备(上海欣软信息科技有限公司); 超氧化物歧化酶(SOD)、五羟色胺(5-HT)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 ASPS的制备

称取刺五加浸膏200 g, 加水至2 000 mL溶解,经醇沉、sevage-木瓜蛋白酶法脱蛋白、醇沉、活性炭粉末脱色素、浓缩、冻干,得刺五加粗多糖,再经纤维素柱层析纯化、透析、浓缩、冻干获得ASPS,苯酚-硫酸法测葡萄糖含量为94.31%。

1.5 动物分组与给药

96只小鼠分2批进行试验,即水迷宫试验和新物体试验。每批48只,随机分为6组,每组8只,分别为空白组、模型组、阳性药物组、ASPS高剂量组(270 mg/kg)、ASPS中剂量组(90 mg/kg)、ASPS低剂量组(30 mg/kg)。除空白组外,其余5组连续7 d, 每天皮下注射尼古丁0.5 mg/kg, 制备尼古丁记忆障碍模型。第7天注射尼古丁24 h后,阳性药物组灌胃吡拉西坦800 mg/kg, ASPS高剂量组、中剂量组、低剂量组分别灌胃ASPS 270、90、30 mg/kg, 连续灌胃7 d。水迷宫试验从第9天开始,给药2 h后,进行水迷宫适应性游泳2 min, 第10～13天连续4 d给药2 h后进行水迷宫定位航行试验,第14天给药2 h后进行水迷宫空间搜索试验。新物体识别试验,从第13天给药2 h后进行新物体识别的适应阶段10 min; 第14天给药2 h后进行新物体识别试验,试验结束动物立即处死,取材。

1.6 Morris水迷宫试验

实验前1 d让小鼠自由游泳2 min适应环境。实验时将小鼠面向池壁除目标象限(Ⅲ象限)之外的3个象限分别放入水中1次,记录小鼠找到平台的时间为逃避潜伏期,连续4 d重复此步骤。第5天先将小鼠在平台上放置30 s, 撤去平台,从目标象限对侧象限(Ⅰ象限)将小鼠放入水中,时间设定为90 s。用super Maze视频采集系统记录每只小鼠潜伏期, Ⅲ象限路程比例、平台穿越次数、平均速度等。

1.7 新物体识别试验

新物体识别试验分为适应、熟悉和测试3个阶段。前1 d将小鼠放置于装置中适应10 min。第2天熟悉期的习得阶段, 2个几乎相同的物体分别放置在箱子一侧的2个角落,小鼠自由探索10 min; 间隔2 h后进行测试阶段10 min, 将其中1个旧物体更换为大小与旧物体相似,但形状、颜色均不同的新物体,以确定小鼠的目标记忆能力。用super Maze 软件记录小鼠头部探索旧物体和新物体的次数和时间,计算辨别指数。

1.8 血清SOD活性和海马组织5-HT含量测定

动物实验结束后,小鼠眼球取血,静置2 h后, 3 000转/min离心30 min, 取上清,测试血清SOD活性,具体实验操作严格按照试剂盒说明书进行。

取血后小鼠立即断头处死,冰上取脑,分离出海马组织,称重。按重量体积比1 g∶9 mL加入9倍体积的PBS(pH值 7.4), 匀浆机粉碎, 3 000转/min离心20 min, 收集上清,备用。Elise法测定小鼠海马组织中5-HT的含量,具体实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.9 统计学方法

实验数据采用SPSS 24.0软件进行处理,以均数±标准差表示,组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析(ANOVA), 组间比较采用LSD法,P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 ASPS对小鼠短期记忆能力障碍的影响

与空白组比较,模型组小鼠的辨别指数降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与模型组比较,阳性药物组及ASPS高、中、低剂量组小鼠的辨别指数升高,差异有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结果表明, ASPS和阳性药物吡拉西坦均能显著减轻尼古丁戒断引起的短期记忆能力障碍,见表1。

表1 ASPS对各组小鼠短期记忆能力障碍的影响

2.2 ASPS对小鼠长期学习记忆能力障碍的影响

与空白组比较,模型组小鼠的逃避潜伏期延长,差异有统计学意义(P<0.05), 表明成功建立了尼古丁戒断记忆障碍模型。与模型组比较,阳性药物组的逃避潜伏期缩短,但差异无统计学意义(P>0.05); 与模型组比较, ASPS高、中剂量组的逃避潜伏期缩短,差异有统计学意义(P<0.05)。与空白组比较,模型组小鼠的平台进入次数、平均速度、Ⅲ象限路程比例降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与模型组比较,阳性药物组小鼠的平台进入次数、平均速度及Ⅲ象限路程比例均增加,但差异无统计学意义(P>0.05), 而ASPS高剂量组小鼠的平台进入次数、平均速度增加,差异有统计学意义(P<0.05), ASPS高、中剂量组小鼠的Ⅲ象限路程比例增加,差异有统计学意义(P<0.05)。结果表明,阳性药物吡拉西坦不能显著减轻由尼古丁戒断引起的长期学习记忆能力障碍,而ASPS能显著减轻长期学习记忆能力障碍,见表2。

表2 ASPS对各组小鼠长期学习记忆能力障碍的影响

2.3 ASPS对各组小鼠血清中SOD活性、海马组织5-HT含量的影响

与空白组比较,模型组小鼠血清SOD活性降低,差异有统计学意义(P<0.01); 与模型组比较,阳性药物组和ASPS高、中、低剂量组小鼠血清SOD活性增加,差异有统计学意义(P<0.01)。与空白组比较,模型组小鼠海马组织中5-HT含量降低,差异有统计学意义(P<0.05); 与模型组比较,ASPS高、中剂量组小鼠海马组织的5-HT含量增加,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05), 见表3。

表3 ASPS对各组小鼠血清SOD活性、海马组织中5-HT含量的影响

3 讨 论

中国2018年开展的第6次全国吸烟流行病学调查[8]显示,大于15岁的吸烟人数达3.08亿, 原来越多的人深陷吸烟的困境,吸烟严重危害健康是不争的事实。戒烟不仅会引发生理、情感等戒断症状,还会造成认知功能障碍,影响学习记忆水平。

新物体识别实验过程分为适应期、熟悉期及测试期,主要用于啮齿类动物非空间、短期对物体辨别记忆能力的检测[9]。本研究发现,尼古丁戒断模型小鼠的辨别指数显著降低,表明尼古丁戒断小鼠新物体识别能力受损; ASPS治疗后小鼠的辨别指数显著增加,表明ASPS在一定程度上可以改善尼古丁戒断小鼠的辨别记忆能力。Morris水迷宫试验是用于检测啮齿类动物学习记忆能力的经典试验,主要包含定位航行试验和空间搜索试验。本研究发现,尼古丁戒断模型小鼠平均速度显著降低,表明其身体健康状况明显弱于正常健康小鼠; 此外逃避潜伏期明显延长,平台进入次数和Ⅲ象限路程比例明显降低,表明尼古丁戒断小鼠学习记忆能力水平明显下降。经ASPS治疗后小鼠的逃避潜伏期显著缩短, Ⅲ象限路程比例、平台进入次数和平均速度显著增加,表明ASPS可明显提高尼古丁戒断小鼠的身体健康状况和改善小鼠的学习记忆能力水平。

造成学习记忆能力减退的因素众多,主要包括氧化应激、炎症反应、中枢神经系统功能减退等方面[10]。海马中存在大量与学习记忆相关的神经递质,如单胺类去甲肾上腺素(NE)、多巴胺(DA)和5-HT, 胆碱类乙酰胆碱等[11]。5-HT又称血清素,在大脑皮层及神经突触中含量很高,参与精神、情绪、记忆等方面的调节。本研究发现,尼古丁戒断模型小鼠海马组织的5-HT含量明显降低,表明尼古丁戒断可能引起海马区单胺类神经递质水平降低; 经ASPS高、中剂量治疗后,小鼠海马区5-HT含量明显增加,表明ASPS可能通过调节神经递质水平来改善尼古丁戒断诱导的学习记忆障碍。

氧化应激是自由基在体内产生的一种负面反应,机体抗氧化能力下降、自由基堆积会造成神经细胞毒性,影响学习记忆功能。SOD是体内一种抗氧化酶[12], SOD活性越低,表明机体内氧化应激损伤越严重。本研究发现, ASPS治疗后尼古丁戒断诱导的模型小鼠血清SOD活性增加,表明抗氧化应激是ASPS改善模型小鼠学习记忆能力障碍的潜在机制。

综上所述, ASPS可以有效改善尼古丁戒断诱导的学习记忆能力障碍,该作用与调节胺类神经递质水平、抗氧化应激作用有关。