姜黄素通过NLRP3炎性体信号通路在肺泡巨噬细胞焦亡模型中的作用机制

吴启文,姚叶萍

(广州医科大学附属第四医院感染科,广东 广州 511300)

急性肺损伤是由感染、创伤等多种原因引起的肺部急性严重疾病,其中感染是主要因素[1]。目前有研究发现细胞焦亡参与急性肺损伤过程,其可能机制是由NLRP3炎性体信号通路介导[2]。感染诱导的ALI目前抗生素是主要治疗方法,但是由于抗生素的不合理应用,细菌耐药率不断升高,甚至出现超级细菌,引起了高度重视。因此中医药在治疗ALI方面的彰显治疗价值。研究证实姜黄素在预防及治疗肺损伤中具有一定的保护作用,可减轻LPS诱导的急性肺损伤小鼠炎性反应,其关键分子靶点可能与 THF-β1/SMAD、Akt/Erk、MAPK/NF-κB、Notch2/Hes-1、TLR4/MyD88/NF-κB等多条信号通路相关[3-5]。目前关于姜黄素在感染性ALI中调控细胞焦亡机制尚未见相关报道。因此,本研究将在LPS/尼日利亚菌素诱导ALI细胞模型中研究姜黄素通过阻断NLRP3炎性体信号通路抑制细胞焦亡改善ALI的作用及机制,旨在为发现姜黄素治疗ALI的可能性及机制提供试验依据。

1 资料与方法

1.1材料

1.1.1细胞:大鼠巨噬细胞系NR8383,购自中科院上海细胞库。

1.1.2主要试剂:姜黄素购自上海麦克林生化科技有限公司;脂多糖(LPS)购自Biosharp公司;F12K培养基购自北京索莱宝生物科技有限公司;胎牛血清购自武汉普诺赛生命科技有限公司);双抗(链霉素+青霉素)购自思拓凡生物科技有限公司;尼日利亚菌素购自麦克林公司;BCA法蛋白含量检测试剂盒购自南京凯基生物发展有限公司;CCK-8购自日本同仁化工;NLRP3抗体(Anti-NLRP3 antibody)、 Caspase-1+p10+p12抗体(Anti-pro Caspase-1+p10+p12 antibody)、GSDMD抗体(Anti-GSDMD antibody)均购自美国Abcam公司;磷酸酶抑制剂购自南京凯基生物发展有限公司,本次研究经过本院医学伦理委员会同意。

1.2方法

1.2.1细胞分组及模型建立:大鼠巨噬细胞系NR8383在含有10%胎牛血清、80%F12K培养基中培养,消化传代后接种12 h后进行分组,分为空白对照组、姜黄素组、LPS 组、LPS+姜黄素组、LPS+尼日利亚菌素处理组、LPS+尼日利亚菌素+姜黄素处理组,并对细胞进行加药处理,给药方法如下:①空白对照组:使用预先加入10%胎牛血清的F12K培养基正常培养,不使用任何药物刺激;②姜黄素组:使用预先加入10%胎牛血清的F12K培养基正常培养,加入10 μmol/L姜黄素进行刺激,2 h后进行检测。③LPS 组:更换无血清培养基12 h后,细胞培养基中加入LPS溶液(终浓度为100 ng/ml),2 h后进行检测。④LPS+姜黄素组:更换无血清培养基12 h后,细胞培养基中加入姜黄素(终浓度为10 μmol/L)和LPS溶液(终浓度为100 ng/ml)进行刺激,2 h后进行检测。⑤LPS+尼日利亚菌素处理组:更换无血清培养基12 h后,细胞培养基中加入LPS溶液(终浓度为100 ng/ml),4 h后实验孔加入尼日利亚菌素溶液(终浓度为10 μmol/ml),2 h后收细胞进行检测。⑥LPS+尼日利亚菌素+姜黄素处理组(3个重复):更换无血清培养基12 h后,细胞培养基中加入姜黄素(终浓度10 μmol/L)和LPS溶液(终浓度为100 ng/ml),4 h后实验孔加入尼日利亚菌素溶液(终浓度为10 μmol/ml),2 h后收细胞进行检测。

1.2.2CCK8法测定各组细胞的活力:大鼠巨噬细胞系NR8383细胞,正常复苏后,用含10%胎牛血清、80%F12K培养基在37℃、5%CO2的条件下培养,每2～3天传代1次。将对数生长期细胞NR8383离心处理,800 r/min,10 min,离心后对细胞进行计数,之后接种于96孔板中,每孔接种2×104个细胞,每孔加100 μl的细胞培养液。接种12 h后进行分组,并对细胞进行加药处理,6个孔/组。各组分别加入相应的药物或试剂后,置培养板于37℃,5%CO2孵箱中培养2 h。2 h后加入CCK-8进行反应,3 h检测各组细胞的OD值。

1.2.3Western印迹法检测细胞中蛋白表达水平:大鼠巨噬细胞系NR8383细胞接种在196孔培养板内,各组给药2 h后弃去培养基,加入裂解液提取细胞内的蛋白,根据蛋白浓度的检测结果将含有20 μl蛋白的样本用于蛋白质印迹检测,依次进行SDS-PAGE电泳、电转PVDF膜、5% 脱脂牛奶封闭、特异性一抗孵育、辣根过氧化物酶二抗孵育,最后在显影系统内采用电化学发光法曝光得到目的 蛋白NLRP3、Caspase-1、GSDMD 及内参蛋白的条带,根据条带的灰度值计算蛋白表达水平。

1.3统计学方法:所有数据应用SPSS21.0软件进行χ2及t检验;计量资料数据方差齐,或数据经转换后方差齐,则采用组间两两比较的单因素方差分析方法;若数据经转换后方差仍不齐,采用秩和检验进行统计分析。百分率的比较采用秩和检验进行统计分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1姜黄素对LPS和尼日利亚菌诱导焦亡细胞增殖率的影响:胞培养在有血清的情况下,与空白组(0.977±0.088)相比,姜黄素(1.111±0.106)提高细胞活力,促进细胞增殖。细胞培养在无血清的情况下,与LPS组(0.746±0.026)相比,LPS+姜黄素组(0.674±0.036)降低细胞活力,抑制细胞增殖,差异有统计学意义(P<0.01);同时在无血清的情况下,与LPS+尼日利亚菌素组(0.138±0.003)相比,LPS+姜黄素+尼日利亚菌素组(0.144±0.006)提高细胞活力,差异有统计学意义(P<0.05),促进细胞增殖。

2.2Western印迹检测姜黄素对LPS和尼日利亚菌诱导焦亡细胞NLRP3、GSDMD蛋白表达情况:与空白对照组比较,姜黄素组细胞的Caspase-1略微降低,NLRP3和GSDMD均呈现升高的趋势。与LPS组比较,姜黄素+LPS组细胞的NLRP3、Caspase-1两个凋亡蛋白均上升,GSDMD凋亡蛋白均下降。与LPS+尼日利亚菌素组比较,LPS+尼日利亚菌素+姜黄素组细胞的NLRP3、Caspase-1、GSDMD三个凋亡蛋白均一致下降,而且下降幅度较大,提示在这个模型的条件下,姜黄素有抑制细胞凋亡的作用。见图1。

图2 Western印迹法检测NLRP3、Caspase-1和GSDMD蛋白在细胞中的表达

3 讨论

ALI是常见的临床危及重症,关于ALI的发病机制以及治疗ALI是目前医学领域的研究热点。感染是ALI常见的发生因素,其中内毒素脂多糖是重要因素之一。研究发现,细胞焦亡与机体在病原体感染时的炎性反应有密切的关系。细胞焦亡是经由Gasdermin家族蛋白介导的质膜膜孔形成的可调控性细胞死亡,经常但并不总因炎性反应性Caspase的活化而完成[6]。肺泡巨噬细胞约占肺内白细胞总数的 95%,巨噬细胞焦亡可以上调炎性反应水平,进一步加重免疫反应失控,参与ALI的发展进程[7]。

姜黄素是姜科姜黄属植物姜黄根茎中提取的一种脂溶性酚类物质。近年来多项研究显示:姜黄素能够通过调节多个信号通路的关键分子靶点,发挥抗炎、抗氧化、抗细胞凋亡、抗病毒、抗癌和免疫调节等活性,从而保护脏器功能[8-11]。

细胞焦亡是机体重要的免疫反应,能快速清除各种病原微生物,限制病菌生长,在拮抗感染和内源性危险信号中发挥重要作用[12-14]。Rühl S及Kayagaki N等学者研究发现,焦亡能发生在括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和李斯特菌等感染宿主细胞的细菌上,同时破坏细菌和宿主细胞,周围未被感染的健康细胞则无任何损伤[15-16]。本研究提示姜黄素可能抑制感染细胞增殖的能力,从而加速机体清除病原。

2018年Kambara等[17]发现不依赖Caspase酶切割 GSDMD引发中性粒细胞焦亡现象,揭示细胞焦亡发生由其识别水解的底物 Gasdermin家族蛋白决定,不由Caspase 酶决定。本研究提示LPS诱导巨噬细胞焦亡损伤模型中,姜黄素可以通过非NLRP3-Caspase-1途径通过下调GSDND蛋白,从而抑制细胞焦亡,具体机制尚待进一步实验验证。

GSDMD蛋白介导细胞焦亡过度发生的伴随大量的包括IL- 1β、IL-18等炎性细胞因子的释放,因此过度的焦亡可能诱导大量炎性细胞的浸润,导致强烈的炎性反应,机体可能出现败血症等严重不良反应[18-19]。本研究结果提示在这个细胞焦亡剧烈的条件下,姜黄素有通过NLRP3炎性体信号通路抑制细胞焦亡的作用。

本研究通过实验证实姜黄素能够显著减轻 LPS/尼日利亚菌素所致致肺泡巨噬细胞的焦亡反应,其机制可能与其抑制抑制NLRP3炎性体信号通路有关。本研究存在不足之处,未同时进行IL- 1β、IL-18炎性因子的检测。目前细胞焦亡的分子机制仍在进一步探索中,姜黄素在生物体内的安全性如何,作用的具体的分子机制如何,均需更多的研究深入探讨。