含铈类碳酸酐酶纳米酶的构筑及在二氧化碳固定中的应用

艾晏如，蔡其君，王 娇，张语桐，白宇佳，陈晓明，吕 瑞

（1.绵阳科技城新区生态节能环保低碳产业技术研究院,绵阳 621010;2.绵阳师范学院化学与化学工程学院,绵阳 621000;3.西南科技大学生命科学与工程学院,绵阳 621010）

自工业革命以来，化石燃料的大量使用导致大气中CO2的浓度急剧上升，引发了全球气候变暖、海平面上升和病虫害增多等诸多负面效应.在当今依然依赖化石燃料发电的大环境下，碳捕获和封存技术（Carbon capture and storage，CCS）成为近年来“双碳”目标下备受关注的热点问题.目前，CCS多采用吸收法、吸附法及膜分离法［1］.其中，吸收法是目前主要采用的方法，该法虽可实现CO2的吸收固定，但仍面临着溶液的回收及二次污染的问题.在自然界中，生物可通过自身代谢循环高效地将CO2转化为可利用化学物质供其生长，其本质是与其机体中产生的酶有关［2］.在生命体中，能用于CO2捕获固定的酶主要为碳酸酐酶（CA）［3，4］.CA是一种含锌的金属酶，也是目前已知的催化效率最高的酶，其可通过催化CO2水化反应及某些酯、醛类水解反应参与多种离子交换，维持机体内环境的稳定.然而，CA在催化过程中极度依赖体系的pH值，当pH＜8时，CA活性明显降低.此外，与其它天然酶一样，CA对环境温度和pH值均有较强的敏感性，极易受极端环境的影响而失活，加之其生产成本高、难以回收利用，因而阻碍了其工业化应用.基于此，受天然酶结构和催化机制的启发，通过人工合成的方式构筑仿生酶成为解决天然酶上述弊端的重要途径.

自2007 年阎锡蕴团队［5］首次报道了Fe3O4纳米粒子具有与天然辣根过氧化物酶类似的催化活性后，无机纳米材料的类酶效应引起了研究者们的广泛关注，由此诞生的纳米酶也被证实为天然酶的理想替代品并广泛用于生物传感、疾病诊疗、环境修复等领域［6，7］.然而，目前所报道的纳米酶多集中于模拟氧化还原酶，而对模拟CA这类水解酶的报道则非常有限.在仅有的报道中，研究者们主要采用含Zn的MOF或其配位聚合物模拟CA活性中心进行CO2的催化转化［8～16］.如，Kim等［8］通过自组装将含组氨酰基的双亲性配体与Zn结合以模拟碳酸酐酶活性中心进行CO2的转化.研究发现，组氨酸上的咪唑基可稳定锌离子从而有助于活性中间体的形成.此外，升温和提高pH值均可显著提高其催化活性，相较于天然酶在高温下极易失活的弊端，该研究结果有力证实了碳酸酐酶纳米酶在工业化应用中的巨大潜力.随着纳米技术的发展，MOF材料以其高比表面积和优异的结构稳定性受到了研究者们的广泛关注.Jin 等［8］合成了一系列含Zn 的MOF 材料并探究了其类碳酸酐酶活性，证实了以Zn 为活性中心的MOF 基纳米酶不仅可高效吸附CO2，还可同时实现CO2的原位转化，为高性能碳酸酐酶纳米酶的开发提供了思路.此外，Liang等［10］以苯三唑为配体，与锌离子结合得到一系列ZnTazs配位聚合物，研究证实，该类配合物具有的与CA类似的Zn—N配位结构是其发挥类碳酸酐酶活性的关键.而Echizen等［11］则发现配体中酚羟基可通过氢键结合水分子，从而可提高水的去质子化形成Zn-OH中间体，进而有助于中间体对CO2的亲核攻击.该类研究为类碳酸酐酶纳米酶的设计提供了参考.然而，除上述以锌为活性中心的类碳酸酐酶外，以其它金属为活性中心构筑类碳酸酐酶纳米酶却未受到足够关注.2015年，Keum等［17］分别以Co，Cd，Ni为活性中心构筑了系列纳米材料并考察了其类碳酸酐酶活性，发现以Co为活性中心的材料表现出了较强的类碳酸酐酶活性.此研究拓宽了类碳酸酐酶纳米酶的研究范围，也为其设计构筑和性能调控提供了新思路.铈作为一种稀土元素，因Ce3+/Ce4+优异的电子传导能力，已被证实具有多种类酶催化活性，但目前针对其类水解酶活性的研究仅集中于类磷酸酶活性［18］，暂未见关于其类碳酸酐酶活性的报道.

层状有机硅酸盐由Mann 课题组首次提出［19］，是一类以硅烷试剂和金属盐为前体合成的、与天然层状硅酸盐结构类似的二维纳米材料.其中，以氨丙基功能化的层状有机硅酸盐备受关注.这类材料可通过氨基的质子化在水中自主分散为纳米单片，从而极大提高材料的水分散性，此外，还可通过调控金属离子的种类使其实现不同的催化性能［20～22］.前期报道表明，碳酸酐酶的催化机理是通过使水去质子化以形成金属—OH中间体，从而促进OH-与CO2结合形成碳酸氢根［23，24］.鉴于此，利用层状硅酸盐中氨基与水中氢离子的结合，将有助于水的去质子化，加之金属中心的强配位能力，有望显著提高CO2的转化效率.因此，本研究以铈盐和氨丙基功能化的有机硅烷试剂为前体，一步合成了具有层状结构的有机硅酸盐，并首次探究了其类碳酸酐酶活性，为CO2的捕获和固定提供了一种高效、节能、环保的新途径.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

七水合氯化铈（CeCl3·7H2O）、乙醇（C2H5OH）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）和盐酸（HCl）均为分析纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES，分析纯）、乙酸对硝基苯酯（p-NPA，分析纯）和碳酸酐酶（CA，≥3000 U/mg，生化试剂），上海麦克林生化科技有限公司.

ULTRA 55型200 kV场发射扫描电子显微镜（SEM），德国蔡司仪器公司；X'Pert PRO型X射线衍射仪（XRD），荷兰帕纳科公司；Spectrum One 型傅里叶变换红外光谱仪（FTIR），美国PE 仪器公司；UV-2800A型紫外-可见分光光度计（UV-Vis），北京普析通用仪器公司.

1.2 实验过程

1.2.1 含铈层状有机硅酸盐（ACOP）的合成 准确称量0.4136 g CeCl3·7H2O，溶于20 mL乙醇中，超声10 min 使其溶解，然后向其中逐滴加入1.3 mL APTES，混合均匀后于室温下搅拌18 h，离心分离，用乙醇洗涤3次后于60 ℃下干燥，得到产物，备用.

1.2.2 ACOP的表征 通过SEM对ACOP的微观形貌进行表征，并利用XRD和FTIR对所合成的ACOP进行物相和结构鉴定.

1.2.3 ACOP 类碳酸酐酶活性的测定 向4 mL 的Tris-HCl 缓冲液（0.01 mol/L，pH=8.0）中加入500 μL ACOP（2 mg/mL）和500 μLp-NPA（20 mmol/L），于室温下反应10 min 后，用紫外-可见分光光度计测定产物于400 nm处的吸光度，通过下式计算表观速率常数（ν，mmol·L-1·min-1），以评价材料的类碳酸酐酶活性：

式中：c为产物浓度（mmol·L-1）；V为反应液体积（mL）；t为反应时间（min）；V'为催化剂溶液体积（mL）.

1.2.4 pH 值对ACOP 催化效率的影响 分别移取500 μL ACOP（2 mg/mL）和500 μLp-NPA（20 mmol/L），置于4 mL不同pH值的Tris-HCl缓冲液中，于室温下反应10 min，用紫外-可见分光光度计测定产物于400 nm处的吸光度，并通过公式（1）得到不同反应pH值下的酶活，以考察反应pH值对ACOP类碳酸酐酶活性的影响.

1.2.5 温度对ACOP 催化效率的影响 分别移取500 μL ACOP（2 mg/mL）和500 μLp-NPA（20 mmol/L）于4 mL Tris-HCl缓冲液（0.01 mol/L，pH=8）中，于不同温度（30～90 ℃）下反应10 min，用紫外-可见分光光度计测定产物于400 nm处的吸光度，并通过公式（1）得到不同反应温度下的酶活，以考察反应温度对类碳酸酐酶的影响.

1.2.6 ACOP的温度耐受性 移取500 μL ACOP（2 mg/mL），分别在30，40，50，60，70，80和90 ℃下放置1 h，冷却至室温后，加入500 μLp-NPA和4 mL Tris-HCl缓冲液（0.01 mol/L，pH=8），于室温下反应10 min，用紫外-可见分光光度计测定产物于400 nm 处的吸光度，并通过式（1）得到ACOP 在各体系下的酶活，以考察ACOP的温度耐受性.同时，用天然碳酸酐酶进行对照实验.

1.2.7 ACOP 的pH 耐受性 移取50 μL ACOP（10 mg/mL），分别在pH=3，4，5，6，7，8，9，10 的450 μL Tris-HCl 缓冲液（0.01 mol/L）中静置5 h，随后加入500 μLp-NPA 和4 mL Tris-HCl 缓冲液（0.01 mol/L，pH=8），于室温下反应10 min，用紫外-可见分光光度计测定产物于400 nm处的吸光度，并通过式（1）得到ACOP 在各体系下的酶活，以考察ACOP 的pH 耐受性.同时，用天然碳酸酐酶进行对照实验.

1.2.8 稳态动力学参数的测定 将底物p-NPA 配制成浓度分别为5，10，15，20，25，30，35，40 mmol/L 的溶液，取500 μL 分别加入500 μL ACOP（2 mg/mL）和4 mL Tris-HCl（0.01 mol/L，pH=8）缓冲液，于室温下反应10 min，用紫外-可见分光光度计测定产物于400 nm 处的吸光度.以底物浓度的倒数-酶反应初速度的倒数绘制Lineweaver-Burk曲线，用Michaelis-Menten公式计算反应的稳态动力学参数：

式中：ν为表观速率常数；［S］为底物浓度（mmol·L-1）；νmax为最大初始反应速率（mmol·L-1·min-1）；Km为米氏常数（mmol·L-1）.

1.2.9 CO2的转化及固定 向pH=8.5的Tris-HCl缓冲溶液中加入20 mL CO2饱和溶液，随后加入ACOP触发反应，使CO2在其催化下转化为通过测定300 s 内体系pH 的变化，评价CO2的转化效率.为进一步实现CO2的捕获固定，向一定量Tris 溶液中加入20 mL CO2饱和溶液、2 mmol CaCl2和一定量ACOP，反应一定时间后形成CaCO3沉淀，过滤、洗涤、干燥后称重，并与未加催化剂体系对比，通过考察缓冲液浓度、催化剂加入量、反应时间等因素的影响，评价ACOP对CO2的固定能力.

2 结果与讨论

2.1 ACOP的结构表征

从SEM 照片可知，所得ACOP 在微观下呈层状堆叠状［图1（A）］；进一步通过TEM 照片发现，ACOP 在溶液中呈分散的片状［图1（B）］，说明ACOP 保留了天然层状硅酸盐所具有的二维层状结构.此外，从元素分布图［图1（C）和（D）］中可见，ACOP保留了前体中的N，O，Si，Ce等元素，且金属中心Ce在材料表面呈均匀分布.为进一步探明其分子结构，通过红外光谱进行表征［图1（E）］.结果表明，3559 cm-1处的峰对应于伯胺中N—H的伸缩振动，2186 cm-1处的峰对应于—NH3+和—NH2中N—H的面内弯曲振动.此外，ACOP结构中还有与硅烷前体有关的基团，如—CHx（2931，1363 cm-1），—Si—C—（1118 cm-1），—Si—O—Si—（1033 cm-1）以及—C—N—（933 cm-1）的吸收带，说明ACOP 保留了有机层状硅酸盐的特征官能团.XRD结果［图1（F）］表明，ACOP在2θ=5°处有明显的衍射峰，对应于ACOP的（001）晶面，进一步计算可知晶面间距d001=1.77 nm，与其它层状有机硅酸盐的层间距接近［21，22］，进一步表明该材料具有层状结构.

为进一步探究金属中心Ce在其结构中的化学态，通过XPS表征了Ce3d轨道电子的结合能，结果见图2.从图中可知，Ce3d轨道的电子会自旋分裂为经进一步拟合分析可知，结合能在880.3，885.4，899.0 和903.6 eV 的峰归属于Ce3+，而结合能在882.0，887.7，897.9，900.8 和906.1 eV 的峰则归属于Ce4+，此外，916.0 eV 的峰为Ce4+的卫星峰.上述结果表明ACOP结构中同时存在Ce3+和Ce4+，两种价态同时存在将有助于其催化作用的发挥.

Fig.2 XPS spectra of ACOP

Fig.3 UV-Vis spectra and the related photographs(inset) of the hydrolysis product of p-NPA in the absence(a) and in the presence(b) of ACOP

2.2 ACOP的类碳酸酐酶活性

按照1.2.3 节中方法测定了ACOP 的类碳酸酐酶活性（图3）.结果表明，当不加入ACOP 时，体系在10 min内没有明显颜色变化；而加入ACOP后，溶液呈明显的亮黄色，且在400 nm处有最大吸收，说明ACOP可催化底物p-NPA的水解反应得到p-NP.经进一步计算可得，2 mg/mL ACOP对p-NPA的催化效率为35 mmol·L-1·min-1，显著优于目前报道的其它碳酸酐酶纳米酶［9，10，15，16］.

2.3 pH值对催化效率的影响

按照1.2.4节方法考察pH值对ACOP催化效率的影响，结果见图4（A）.在pH=8时，ACOP对底物的水解效率最高，而这一现象也与天然碳酸酐酶一致，证实了ACOP的仿生催化能力.

Fig.4 Influences of pH value(A) and temperature(B) on catalytic efficiency of ACOP

2.4 温度对催化效率的影响

按照1.2.5 节中方法考察了温度对ACOP 催化效率的影响，结果见图4（B）.随着温度的升高，ACOP的催化效率先增大后减小，在50 ℃时达到最高.这是因为升高温度可加速粒子间的碰撞，从而促进反应的进行，但温度过高又会使得空白值增加，无法体现催化剂的效能.从节能环保的角度考虑，催化剂的使用不仅可极大缩短反应时间，还能降低能耗，加之工厂烟囱所排气体的温度多在50 ℃左右，与ACOP的最适反应温度一致，因此ACOP在实际生产环境中具有极大的应用潜力.

2.5 ACOP的温度耐受性

按照1.2.6节中方法比较了ACOP 和CA 的温度耐受性.以温度为30 ℃时的酶活为基准计算各温度下的相对酶活.由图5（A）中结果可知，ACOP在高温下也能保持90%以上的活性，且酶活性随温度变化较小.相反，CA在超过50 ℃后酶活迅速下降，由此说明ACOP具有优异的温度耐受性.

Fig.5 Temperature(A) and pH(B) tolerance of ACOP

2.6 ACOP的pH耐受性

按照1.2.7 节中方法比较了ACOP 和CA 的pH 耐受性.以pH=7 时的酶活为基准，计算各pH 值下的相对酶活，结果见图5（B）.从图5（B）可知，ACOP在极酸、中性和极碱环境中也能保持90%以上的活性，而CA在酸性条件下活性会显著降低，说明酸性环境会导致其构象变化，进而影响酶活.由此可知，ACOP具有优异的pH耐受性.

2.7 动力学参数

按照1.2.8节中方法计算得到不同底物浓度下ACOP的表观速率常数.以底物浓度的倒数（c-1）为横坐标，反应初速度的倒数（v-1）为纵坐标绘制Lineweaver-Burk 双倒数曲线，并进一步按照Michaelis-Menten公式计算反应的米氏常数（Km）和最大初始反应速率（Vmax）.其中米氏常数是指达到酶促反应最大速率的一半时所需要的底物浓度，可反映出催化剂与底物之间的亲和能力，通常其值越小，说明催化剂与底物之前的亲和能力越强.由Lineweaver-Burk曲线（图6）拟合米氏方程可得，ACOP的米氏常数（Km）为63.7 mmol/L，最大初始反应速率（Vmax）可达212 mmol·L-1·min-1，而天然碳酸酐酶的米氏常数则为154 mmol/L，最大初始反应速率为102 mmol·L-1·min-1.可见，ACOP 的米氏常数值小于天然酶CA，而最大初始反应速率更高，说明ACOP与底物之间有更强的亲和作用，可提高催化反应速率，有利于催化反应的进行.

Fig.6 Lineweaver-Burk plots of ACOP(A) and CA(B)

2.8 ACOP在CO2固定中的应用

目前，对CO2的处理主要有两类方法，一是通过碱性吸收液将CO2吸收固定［1］，二是利用仿生催化原理将CO2在碱性条件下转化为沉淀固定.前者虽然操作简便，但也存在着后处理繁琐及吸收液的二次污染问题.而通过模拟碳酸酐酶将CO2转化后，再原位与钙离子形成碳酸钙沉淀的方式已成为当前CCS发展的新趋势［8～11，15，16］.因此，本研究进一步将构建的ACOP催化体系用于CO2的转化及固定.

首先，通过测定体系在300 s 内的pH 值变化，考察不同浓度催化剂对CO2的转化能力，结果见图7.由图中可知，随着CO2的通入，ACOP 催化体系的pH 值较空白组（未加ACOP）下降更显著，终值更低，说明ACOP可催化CO2水合形成重碳酸盐.此外，从图中还可以看出，随着ACOP 浓度的增加，体系的pH 值下降速度加快，当ACOP 浓度为3 mg/mL 时，体系pH 值在150 s 时即可降至6.6左右，说明ACOP在CO2的催化转化中具有明显的量效关系.

随后，进一步将ACOP催化体系用于CO2的固定.按照1.2.9节中方法，向含CaCl2的Tris溶液中加入ACOP和饱和CO2溶液，经过混合反应后，对产生的沉淀进行烘干称重，并以未加ACOP体系作为空白对照，以扣除空白后的碳酸钙质量评价ACOP催化固定CO2的性能.为系统评价ACOP对CO2的固定能力，首先，考察了反应时间对碳酸钙产量的影响.由图8（A）结果可知，当反应2 h后，碳酸钙的产量不再变化，说明2 h后反应已经进行完全，因此后续反应时间设定为2 h.随后，进一步考察了缓冲溶液浓度对催化固定效率的影响.由于缓冲溶液对H+具有稳定作用，可加快水的脱质子反应，促进CO2与氢氧根结合形成碳酸氢根，因而推测高浓度的Tris 溶液所具有的更大的缓冲容量将有助于产物的生成.分别设定Tirs 浓度为0.1，0.2，0.4 和0.5 mol/L，按照1.2.9 节中方法进行实验，结果见图8（B）.从图中可知，随着缓冲溶液浓度的增加，CO2的产量先增大后减小.在实验中还发现，缓冲溶液浓度增加也会伴随着ACOP的析出，从而影响碳酸钙沉淀的纯度，因此选择缓冲溶液浓度为0.2 mol/L.最后，考察了ACOP加入量的影响.分别向上述体系中加入40，60，70，80 mg ACOP，按照1.2.9节中方法进行实验，结果见图8（C）.从图中可知，随着ACOP加入量的增加，碳酸钙产量也逐渐增加，但当ACOP用量高于60 mg后，碳酸钙质量变化不大，这与前述CO2的转化实验结果一致，说明在该溶液体系下，CO2的转化率已达最大.综上，在0.2 mol/L Tris缓冲溶液中加入60 mg ACOP反应2 h，可使碳酸钙的产量达到0.0331 g.由于ACOP的合成条件温和，成本较低，且在极端环境下具有优异的催化稳定性，因此，比目前报道的其它非锌中心的碳酸酐酶纳米酶具有更大的应用潜力［17］.

Fig.7 pH changes of CO2 catalyzed by ACOP at different concentrations

Fig.8 Effects of reaction time(A),concentration of buffer(B),and dosage of ACOP(C) on the production of CaCO3

3 结论

通过一步溶胶-凝胶法，在室温下合成了铈层状有机硅酸盐ACOP，并探究了其类碳酸酐酶活性.研究发现，ACOP保留了天然层状硅酸盐特有的二维层状结构，且具有优异的类碳酸酐酶活性.与天然CA相比，ACOP对极端温度和pH值均有较强的耐受性，当温度高于70 ℃时，天然酶已经近乎失活，而ACOP仍能保持90%以上的催化活性.此外，通过对比动力学参数可知，ACOP具有比CA更强的底物亲和能力和高效的催化活性，是一种理想的天然碳酸酐酶替代品.最后，将ACOP用于CO2的固定，发现当加入ACOP后，体系的pH值随CO2的加入而逐渐降低，且其下降程度与ACOP的浓度具有量效关系，而当体系中存在钙离子时，ACOP可催化CO2的转化并最终将其固定为碳酸钙沉淀，实现了CO2的捕获固定.本研究为类碳酸酐酶纳米酶的构筑提供了新方法，也为CO2的高效捕获提供了一种绿色、环保、节能的新途径.