水化层影响酸酐酶内CO2扩散行为的分子动力学模拟

陈功，卢滇楠，吴建中，刘铮



水化层影响酸酐酶内CO2扩散行为的分子动力学模拟

陈功1，卢滇楠1，吴建中2，刘铮1

（1工业生物催化教育部重点实验室（筹），清华大学化工系，北京100084；2Department of Chemical & Environmental Engineering, University of California, Riverside, CA 92521,USA）

气相中酶分子表面的水化层对其催化行为具有显著的影响。本文采用全原子分子动力学模拟方法考察了气相体系碳酸酐酶表面的水化层对酶结构以及CO2在酶分子中扩散行为的影响。首先展现了水分子在酶分子及其活性中心周围的分布，研究了水化层厚度对于酶结构以及CO2扩散速率的影响；发现最有利于CO2扩散进入酶分子的水化层厚度为0.7 nm。确认了碳酸酐酶内CO2的吸附位点，通过对其开合状态统计，显示出碳酸酐酶中CO2扩散通道中的瓶颈位置。上述结果对设计和优化碳酸酐酶催化气相体系中CO2的吸附和转化提供了依据和启示。

碳酸酐酶；CO2；扩散；水化层；吸附位点

引 言

CO2的捕集和转化技术创新对于其减排和利用具有重要的意义。目前所发展的CO2的捕集方法主要包括吸收、吸附、膜分离等[1]。化学吸收是其中应用最为广泛的方法，单乙醇胺或其衍生物等是应用最广泛的吸收剂，其吸收容量大、速度快，但解吸热高，并存在氨泄漏和污染等风险[2]。自然界中碳酸酐酶催化CO2转化为HCO-3的转化数高达104～106s-1，远远高于传统化学吸收法（转化数约为103～104s-1）[3-4]，如果能够充分发挥酶对底物的高度选择性以及酶促反应温和可控特性的优势，实现气相中CO2的直接捕集，则免除CO2溶解到液相的步骤并避免了溶解平衡对于吸收过程的限制，这对于处理低浓度CO2尤为有益。

目前碳酸酐酶尚未在CO2的捕集和转化中得到工业应用，这其中存在两个瓶颈问题：一是如何提高碳酸酐酶的稳定性以使其满足不同实际工况；二是如何合理地使用碳酸酐酶以强化底物分子的扩散。现代生物工程技术为通过分子改造（如定点突变和定向进化[5]）或者化学修饰（如纳米固定化[6-8]）等来提高酶稳定性提供了丰富的技术选择；而CO2的吸附过程强化则可从热力学和动力学两个方面入手优化体系组成和操作过程，提升吸附容量和速度。

碳酸酐酶是一类金属酶[9]，其中锌离子处于四面体配位的环境中，是发生CO2转化反应的活性中心。酶分子表面会存在必需水分子（essential water）来维持酶分子的立体构象[9]。因此CO2从气相扩散进入碳酸酐酶需依次穿过气-液相界面、碳酸酐酶-水相界面、进入碳酸酐酶内部孔道、扩散到活性中心部位发生反应。因为产物水溶性优于反应物，所以有利于反应沿着气相压力降低的方向进行。近年来碳酸酐酶催化CO2水合反应的机理研究取得了丰富成果[10-15]，相比较而言，对于CO2扩散进入碳酸酐酶的微观机制研究有待深入。本文采用分子模拟的方法来揭示碳酸酐酶表面水化层对于酶分子结构及CO2扩散过程的影响特性，这对于强化碳酸酐酶催化CO2转化具有重要意义。

本文首先研究了水分子在碳酸酐酶及其活性位点区域的立体分布，揭示了水化层厚度对于酶分子结构刚/柔特性及对于CO2扩散入碳酸酐酶的影响，发现水化层厚度存在最优值。通过确认CO2扩散所涉及酶分子吸附位点，给出了CO2在碳酸酐酶分子内的扩散通道，通过分析各吸附位点开闭状态找出了CO2扩散通道中的瓶颈位置。上述分子模拟再现了相关实验研究结果[16-18]，为碳酸酐酶分子改造、修饰及其应用于CO2的吸收和转化提供了有益的依据和启迪。

1 模型与模拟方法

1.1 模型建立

模拟所选用的力场为CHARMM27[19-20]，水分子模型选用TIP3P模型[21]，CO2分子模型来自John Straub[22]，锌的金属配位结构用非键相互作用表示[23]。碳酸酐酶结构取自pdb数据库（ID：2CBA[24]），模拟体系初始盒子大小为15 nm×15 nm×15 nm，碳酸酐酶置于盒子质心，在碳酸酐酶表面分别放置0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3和1.5 nm厚度的水分子层，盒子内再放入5000个CO2分子。

1.2 模拟方法

分子动力学模拟软件为NAMD[25]。采用NPT系综和Langevin控温[26]控压[27]方法。本文是对气相催化领域的前期探索，旨在研究高压下CO2的酶法快速吸收与转化，故设置模拟压力为5 MPa，温度为293 K；此压力温度下CO2仍为气态。模拟过程中，采用周期性的边界条件。模拟过程先经过100步的能量最小化，然后限制蛋白骨架模拟1 ns，接着模拟50 ns。除了计算CO2聚集位点，其他性质均由后25 ns的模拟数据统计分析得到。模拟步长为2.0 fs。采用particle mesh Eward（PME）方法[28]计算电荷相互作用，其截断距离为1.2 nm。非键范德华力采用12-6 Lennard-Jones势函数计算，其截断半径为1.2 nm。

2 结果与讨论

2.1 碳酸酐酶分子内部水分子的分布

采用上述模型首先考察了水分子和CO2分子在碳酸酐酶分子内部和周围的分布，结果如图1所示。

由图1可知，加入到体系中99%以上的水分子均紧紧贴附在碳酸酐酶形成水化层，距酶质心的最远距离可达到1.5 nm。经计算，其与碳酸酐酶表面氨基侧链形成的氢键平均寿命大于0.03 ns，而纯水相中氢键平均寿命为0.023 ns，这种氢键作用是水化作用的主要来源；经计算其自扩散系数均小于2.44 nm2·ns-1，低于纯水中水分子自扩散系数2.923nm2·ns-1，表明由于水分子层与碳酸酐酶亲水相互作用较强，导致水分子向气相主体相扩散受限，这与Berendsen等[29]所观察到的实验结果一致。由图1还可以观察到，当水分子层厚度为0.5 nm时，水化层已能够完全覆盖碳酸酐酶。对CO2而言，随着水化层厚度增加，能够进入到距离碳酸酐酶质心1.5 nm以内的CO2分子数目逐渐减少，当水化层厚度超过0.9 nm时，CO2在水化层表面呈现无规分布。

图2给出了水化层厚度对碳酸酐酶RMSD的影响。随着水化层厚度的增加，碳酸酐酶RMSD先逐渐降低，当水化层厚度大于0.5 nm 时，碳酸酐酶RMSD不再随水化层厚度发生显著变化，即碳酸酐酶结构保持稳定。这首先可归结为水分子与碳酸酐酶表面结合水所形成的稳定的氢键网络，此外该水分子层还可以消弱CO2通过疏水作用力对碳酸酐酶结构的影响。

图3给出了锌离子结合的氧原子（来自水分子）周围水分子上氢原子的径向分布函数图，0.1～1.1表示水化层的厚度（nm）。图中显示：位于锌离子周围0～1.0 nm的水分子有3～4个峰，这是由碳酸酐酶内部形成质子传递链的水分子所形成的，表明在气相中该水链能够稳定存在，具体如左侧微观图所示，这与水相中碳酸酐酶的理论研究结果一致[10-15]。位于1.0～4.0 nm区域的水分子有1个明显的峰，随着体系水分子数增大，这个峰由尖锐变为平缓，表明碳酸酐酶表面水化层厚度增大。根据峰型能够将该峰划分为1.0～1.5、1.5～2.0、2.0～3.0 nm三层溶剂化层，而在位于4.0 nm以外所有峰都逐渐衰减为0，进一步说明所模拟的气相体系中的水分子聚集在碳酸酐酶表面。

图4(a)表明随着水化层厚度的增加，水化层中形成了氢键网络，氢键数目与水化层厚度分别取对数后线性拟合，拟合度达0.996，其斜率为17.2，说明水分子集中在碳酸酐酶周围且氢键数目随水化层面积增大而增大，这与图3的结果相互印证。图4(b)显示，随着水化层厚度增加，碳酸酐酶内部的氢键数目减少30%，表明其二级结构的强度逐渐趋近于水相中二级结构。

2.2 水化层厚度对CO2在碳酸酐酶内部扩散的影响

在293 K、5 MPa下考察了CO2吸附量随水化层厚度的变化，结果如图5所示。

图5结果表明随着水化层厚度的增加，CO2的平衡吸附量随着水化层厚度的增加由1.7%降低到0.2%。这可能是由于水化层厚度增加，在碳酸酐酶表面形成了紧密的氢键网络，界面张力增加，这使得CO2扩散到碳酸酐酶内部并进而发生吸附的难度增大。

图6给出了锌结合水上氧原子与其周围CO2的氢和氧的径向分布函数图，0.1～1.1表示水化层的厚度（nm）。图6(a)、(c)显示了进入到碳酸酐酶孔道内的CO2围绕结合水的分布情况；图6(b)、(d)显示了吸附在碳酸酐酶表面的CO2围绕结合水的分布情况。

在碳酸酐孔道内[图6(a)、(c)]，CO2的分布密集程度（峰高）不随水化层厚度的增大而单调升高或降低，而存在着最大值。

当水化层厚度为0.7 nm时，CO2分子在碳酸酐酶的孔道内的分布最多（峰最高），即当水化层厚度为CO2分子直径的3倍时，CO2最易扩散到碳酸酐酶的孔道。这可能是由于当水化层厚度小于0.7 nm时，碳酸酐酶刚性较大，CO2不易扩散到碳酸酐酶的孔道中。而当水化层厚度大于0.7 nm时，碳酸酐酶表面水化层对于CO2的阻碍作用较强，也对CO2的扩散造成了影响。图6(b)、(d)结果表明，随着水化层厚度的增加，CO2的峰型逐渐滞后变宽，说明水化层增厚排斥CO2分子，将其推离碳酸酐酶表面。除此之外，比较图6(a)、(c)可以发现当水化层厚度为0.7 nm时，O峰裂分为0.33和0.51 nm两处峰，表明了CO2两个氧原子距离结合水的氧原子的距离存在差异。

进一步从能量角度分析了CO2与碳酸酐酶的非键相互作用，如图7所示。由图7可知，碳酸酐酶与CO2的范德华相互作用强于静电相互作用。而随着水化层厚度的增加，CO2与碳酸酐酶表面直接接触的概率降低，导致两者的相互作用逐渐减小。

图7 CO2与碳酸酐酶非键相互作用

2.3 水化层对吸附位点的影响

为分析水化层对于CO2扩散过程的影响，考察了水化层厚度对于碳酸酐酶表面吸附位点的影响。通过cluster算法得到了在水化层内的碳酸酐酶的63个吸附位点，再通过K-center算法把得到的63个吸附位点根据空间位置的划分，分为20个粗粒化吸附位点，结果如图8所示。

表1给出了组成这前10个（共20个）吸附位点的氨基酸（即吸附位点0.15 nm以内的氨基酸），吸附位点的序号由距离活性位点结合水的距离由近到远排序给出。

表1 前10个粗粒化吸附位点的氨基酸组成

The adsorption sites are represented by sphere, the colors from red to blue indicates their distances to the active sites are from near to far, cartoon model[30]for carbonic anhydrase

进一步地计算了图8所显示的各个吸附位点的开合关闭情况。碳酸酐酶内部各氨基酸中原子大小以范德华半径计算，如果一个吸附位点能够保持半径为0.15 nm的空腔，则该吸附位点在此时刻为“开合”状态，反之为“关闭”状态。

图9给出了最重要的吸附位点1的开合关闭情况随水化层厚度的变化关系[图9（a）]及20个吸附位点的总开合关闭率随水化层厚度的变化关系[图9（b）]。图9（a）表明，最重要的第一个吸附位点的开合率小于15%，表明CO2分子由气相进入到碳酸酐酶孔道内部向最重要的吸附位点cavity 1的扩散是相对较难，是扩散的瓶颈位置。水化层为0.7 nm时的平均开合率为32.5%，为最高。水化层厚度0.7～1.3 nm时的平均开合率为28%以上。但根据图6来看，0.3～0.9 nm的水化层有利于CO2分子扩散到碳酸酐酶内部孔道，这说明不能仅靠吸附位点的开合关闭情况来判断水化层对CO2扩散入碳酸酐酶的影响。

综上所述，水化层厚度增大一方面有利于避免碳酸酐酶结构受到CO2的破坏，打开吸附位点，但当水化层过厚时，水化层中形成的致密水分子网络导致CO2扩散阻力增大，故存在最优的水化层厚度，在本文模拟的工况下，最适宜的水化层厚度为0.5～0.9 nm。

3 结 论

本文采用全原子分子动力学模拟研究了气相中CO2扩散进入碳酸酐酶的过程。首先考察了水分子在酶分子周围内和活性中心的分布，发现气相体系中水分子紧紧围绕着碳酸酐酶形成了水化层。进一步地考察了水化层厚度对于碳酸酐酶结构及CO2吸附量的影响，发现最有利于CO2扩散进入酶分子的水化层厚度为0.7 nm。通过分子模拟确认了碳酸酐酶分子内CO2的吸附位点，通过对其开合状态统计，显示出碳酸酐酶中CO2的扩散通道及其中的瓶颈位置。上述结果给出了二氧化碳扩散从气相主体扩散进入碳酸酐酶过程的分子图景，为强化碳酸酐酶对CO2的吸附和转化提供了有益的参考和启示。

符 号 说 明

RMSD——root mean square deviation，方均根偏差 RDF——radial distribution function，径向分布函数 Elec——electrostatic potential，静电相互作用势 VDW——van der Waals potential，范德华相互作用势

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Molecular dynamics simulation for hydration effect on CO2diffusion in carbonic anhydrase

CHEN Gong1, LU Diannan1, WU Jianzhong2, LIU Zheng1

(Key Laboratory for Industrial BiocatalysisPreparingMinistry of EducationDepartment of Chemical EngineeringTsinghua UniversityBeijingChina;Department of Chemical & Environmental EngineeringUniversity of CaliforniaRiversideCAUSA

The hydration layer of the enzyme in the bulk gas phase has great effects on its catalytic performance. Molecular dynamics (MD) simulations at all-atom level was applied to investigate the effects of the hydration layer thickness on the diffusion of carbon dioxide molecules into the active site of a carbonic anhydrase enzyme from a bulk gas phase. Based on the distribution of water molecules surrounding the carbonic anhydrase enzyme, the effects of the hydration layer thickness on the protein structure and CO2transport from the bulk gas phase to the protein active site was studied. The simulation results suggested an optimal hydration layer thickness of 0.7 nm for CO2diffusion. The CO2adsorption sites were identified, which compose of the diffusion channel inside the carbonic anhydrase. The MD simulation revealed the open states of these adsorption sites, which may be useful to identify the bottleneck position of the diffusion channel. The molecular insight is helpful for design and optimization of carbonic anhydrase, enabling more efficient CO2adsorption and conversion.

carbonic anhydrase; carbon dioxide; diffusion; hydration layer; adsorption sites

2015-06-01.

LU Diannan, ludiannan@ tsinghua.edu.cn; LIU Zheng, liuzheng@mail.tsinghua.edu.cn

10.11949/j.issn.0438-1157.20150773

TQ 021.4

A

0438—1157（2015）08—2903—08

卢滇楠，刘铮。

陈功（1991—），男，博士研究生。

国家自然科学基金项目（21028006）。

015-06-01收到初稿，2015-06-10收到修改稿。

supported by the National Natural Science Foundation of China (21028006).