棉酚降解酵母的筛选及其在棉粕发酵中的应用

张国玉,柴 娟,叶冬明,李新民,陈天明,蔡国林,*

1. 新疆冠农股份有限公司 (巴州 841000) 2. 新疆冠农检测科技有限公司 (巴州 841000) 3. 新疆天牧生物科技有限公司 (和静 841300) 4. 江南大学粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心 (无锡 214122)

棉粕是我国动物养殖的主要蛋白饲料来源,但由于其含有包括棉酚在内的有害物质或抗营养因子[1],在较高添加量下对动物的生长性能产生负面影响,降低营养物质的有效消化和利用率,甚至导致动物器官损伤[2]。因此,降低棉酚含量是解决棉粕应用限制的关键因素。关于棉酚脱毒技术已经有了较多的研究和进展,将脱毒方法按照性质来分,可分为物理法、化学法和生物发酵法[3-4]。物理法和化学法在降解棉粕中有害棉酚方面各有优势,但存在着棉粕营养物质大量流失和化学药品残留等缺陷。相比之下,微生物固态发酵法通过在适宜条件下将有益微生物接入原料进行发酵,成本较低,易于操作,脱毒效率高[5]。微生物在固态发酵中产生一系列的水解酶,可以将大分子蛋白分解为小分子肽,从而提高动物对原料的吸收率,代谢产物还能赋予原料芳香味,提高适口性[6]。此外,微生物固态发酵还可以代谢产生一系列的有机酸和抗菌肽等功能性成分,是养殖行业抗生素的潜在替代物[7]。

研究发现,国内外存在许多可降解棉粕中游离棉酚的微生物,但每种微生物应用于棉粕发酵都存在一定限制。例如,霉菌虽然具有降解棉酚的能力,但在动物饲料中的使用安全性仍受到怀疑[8]。芽孢杆菌在氨基酸代谢中会产生刺激气味的氨和吲哚类物质等,影响发酵风味[9],而乳酸菌对棉酚的降解效果较差[10]。酵母富含蛋白质、氨基酸、有机酸、维生素、矿物质和生长因子等营养物质。此外,还含有葡聚糖、甘露聚糖、各种寡肽、几丁质、核苷酸等生物活性物质,因此酵母是国内固态发酵饲料开发的重要益生菌资源[11]。酵母一直被广泛应用于各类发酵食品的制作,并具有一定的安全性,其代谢产物无毒,并且具有良好的发展前景[12]。因此,酵母在降解棉酚方面可能是一个更为可靠的选择。

因此,通过棉酚选择培养基和固态发酵方式筛选出能显著降解游离棉酚的酵母,同时进行多级驯化与益生性能评估,并将其初步应用于棉粕的固态发酵中,为提高以棉粕为基质的酵母培养物的营养品质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

棉粕,由新疆天牧生物科技有限公司提供。

1.2 培养基

PDA培养基:葡萄糖20.0 g,蛋白胨10.0 g,酵母粉10.0 g,水1 000 mL;配制固体培养基时添加2.0%的琼脂粉。

降解棉酚选择培养基: (NH4)2SO45 g,KH2PO41 g,CaCl21 g,MgSO40.5 g,酵母粉 0.2 g,NaCl 0.1 g,醋酸棉酚 0.3%,pH 值 6.6,琼脂 17 g,蒸馏水 1 000 mL,121 ℃ 灭菌 20 min。

棉粕固态培养基: 称取经粉碎过20目筛的棉粕20 g,加入20 mL无菌水于500 mL三角瓶中,四层纱布封口,121 ℃ 灭菌 20 min,备用。

1.3 方法

1.3.1菌种的分离与纯化

取1 g棉粕原料置于含有0.3%棉酚但不含有葡萄糖的10 mL PDA液体培养基中,30 ℃静置培养2 d,混匀吸取培养液1 mL,用无菌生理盐水依次稀释10-1、10-2、10-3、10-4倍,每个稀释度取100 μL涂布于PDA固体培养基中,30 ℃培养48 h,观察培养基菌落生长,挑取有明显酵母形态且独立生长的菌体于PDA固体培养基划线纯化,再挑取单菌种于PDA液体培养基静置培养24 h,甘油管保藏。

1.3.2降解棉酚酵母菌的初筛

在接种过程中,取甘油保藏的菌株,按照2%的接种量加入1 mL PDA液体培养基中。经过24 h的培养后,将菌液转移到3 mL PDA培养基中。吸取25 μL的菌液并接种于降解棉酚选择培养基中,在30 ℃条件下培养48 h。挑选能够在该培养基中生长的菌株于PDA液体培养基中,待菌液的OD600值达到0.6～0.7后,将这些菌液定量转移到50 mL含有0.3%的棉酚PDA液体培养基中,在30 ℃、220 r/min的条件下培养48 h,并进行涡旋震荡,取200 μL的菌液放入96孔板中,并测定其OD600值。通过比较菌体生长情况,筛选出在棉酚胁迫环境下具有较强生长能力的菌株。

1.3.3降解棉酚酵母的复筛

将初筛所得的菌株进行液态培养,取相同OD水平的酵母,借助棉粕固态培养基进行固态发酵,发酵结束后,于60 ℃烘干,测定各菌株的棉酚脱除效果,每组处理 3个重复。

1.3.4酵母的形态观察与鉴定

(1)酵母的形态观察:使用接种环,从待观察的酵母培养基中挑取单个菌落,并将其转移到载玻片上。随后制作水浸片,并在放大倍数为10×40的光学显微镜下进行观察。

(2)酵母的鉴定:使用Ezup柱式酵母基因组DNA抽提试剂盒提取 DNA,用于后续的PCR扩增。对PCR扩增后的产物进行测序,获得的基因序列将通过在NCBI(National Center for Biotechnology Information)上进行Blast比对分析。

1.3.5酵母的驯化

(1)驯化培养基的制备:将5 g酵母膏和10 g胰蛋白胨加入适量水中,一级、二级、三级驯化培养基中分别添加0.2%、0.4%和0.6%棉酚,加至总体积1 000 mL,使pH自然调节。对于固体培养基,加入2%琼脂,并在121 ℃下灭菌20 min。

(2)菌株驯化过程:将筛选所得的酵母进行逐步的三级驯化过程。首先,将保存的菌种活化,并在一级驯化固体培养基平板上进行第一次点菌。然后,从较大的菌落中挑选出来,转移到一级驯化液体培养基中进行扩培。接下来,在二级驯化固体培养基平板上进行第二次点菌,并从较大的菌落中挑选出来,转移到二级驯化液体培养基中进行扩培。最后,在三级驯化固体培养基平板上进行第三次点菌。针对经过三级驯化的菌株,将其活化后以10%的接种量进行固态发酵。发酵结束后,测定样品中游离棉酚的含量。

1.3.6酵母耐酸和耐胆盐实验

(1) 酸耐受性实验

将活化增殖的菌株以10%的接种量接入不同pH的PDA液体培养基中,然后在30 ℃的摇床上培养48 h。同时设立以自然pH值为对照的实验组,并进行活菌计数,计算酸耐受力[13-14]。

式中:N1为12 h培养基活菌数,CFU /mL;N为不调整pH的PDA培养基活菌数。

(2)胆盐耐受性实验

将活化的菌株以10%的接种量接入添加不同浓度胆盐的PDA液体培养基中,并在30 ℃的摇床上培养48 h。同时设立未添加胆盐的PDA培养基为对照组,并进行活菌计数,计算胆盐耐受力。

式中:N1为12 h培养基活菌数,CFU /mL;N为不添加胆盐的PDA培养基活菌数。

1.3.7驯化后的酵母在棉粕发酵上的初步应用

将驯化后的酵母在PDA液体培养基上培养至对数期,按10%接种量接种于棉粕固态培养基中,其中加入 0.15% MgSO4和0.3% K2HPO4。发酵结束后,将棉粕固态培养物于60 ℃烘干,然后测定pH、总酸含量、游离棉酚含量、粗蛋白含量、酸溶蛋白含量和棉籽糖含量。

1.3.8测定方法

游离棉酚含量的采用HPLC方法进行测定。称取2.00 g样品,加入20 mL乙腈-0.2%磷酸溶液(85∶15),室温下磁力搅拌1.5 h,超声15 min,8 000×g离心10 min,上清液过0.22 μm有机微孔滤膜,经高效液相色谱仪测定[15]。

粗蛋白含量的测定采用凯氏定氮法,依据国家标准GB/T 6432—2018进行测定[16]。酸溶蛋白含量采用凯氏定氮法,和植酸含量的测定参照乔晓艳的方法进行[6]。

pH采用pH计测定,5 g样品加50 mL水振荡摇匀30 min,直接测定pH。总酸含量的测定:将溶液过滤后离心取上清,加水稀释,用已标定好的NaOH溶液滴定,总酸含量以乳酸计[17]。

棉籽糖含量采用HPLC进行测定。称取粉碎样品5.00 g, 采用50 mL 80%的乙醇, 水浴70 ℃浸提1 h,过滤取上清液, 滤渣洗涤3次, 合并滤液, 旋转蒸发, 定容到25 mL,随后采用带示差检测器的HPLC进行测定[18]。

2 结果与讨论

2.1 降解棉酚酵母的初筛

将经过棉酚降解选择培养基筛选出来的81株菌进行液态生长能力测试,结果如图1所示。其中有70株菌的OD值低于0.6,其原因可能是在含有0.3%棉酚的液态生长环境中,棉酚的胁迫作用更为明显,对菌株生长造成毒害作用。因此,选择能在棉酚降解选择培养基和含有棉酚的液态培养基中长势相对较好(OD>0.6)的11株菌继续进行下一步筛选,并将这11株菌分别命名为TM-1～TM-11。

图1 初筛菌株在0.3%棉酚-PDA液体培养基中生长情况的频数分布图

2.2 降解棉酚酵母的复筛

初筛得到的11株菌,经过纯化活化得到菌液,继而利用棉粕固态培养基进行固态发酵实验,接种量按1.0×107CFU/g接入,30 ℃发酵48 h,发酵结束后测定游离棉酚含量,结果见图2。由图2可知,原料棉粕本身棉酚含量较高,达到578 mg/kg,经微生物发酵后,棉酚含量都有所降解,最为显著是TM-2,棉酚含量仅为147 mg/kg,降解率达到74.6%。因此,选择TM-2为固态发酵棉粕降解棉酚的功能菌株。

图2 初筛11株菌固态发酵棉粕后游离棉酚含量

2.3 酵母TM-2的形态观察与鉴定

将菌株接种在YPD固体培养基上,置于30 ℃恒温培养箱静置培养2 d。如图3a所示,菌株TM-2的菌落形态为形状饱满的圆形结构,呈现出白色的凸起,表面干燥且具有粗糙的纹理,边缘整齐且清晰可见,犹如绒毛覆盖。再将菌株TM-2接种到YPD液体培养基中,然后在恒温摇床上以30 ℃、170 r/min的条件下培养18 h。培养完成后,制备水浸片并通过显微镜10×40观察。在观察中发现,菌株TM-2的细胞形状呈现椭圆形,并表现出典型的出芽生殖特征,如图3b所示。将TM-2的ITS序列进行BLAST分析,鉴定菌株TM-2为产朊假丝酵母,命名为产朊假丝酵母TM-2。

图3 酵母TM-2菌落形态和显微形态

2.4 产朊假丝酵母TM-2对棉酚降解能力的驯化

将假丝酵母TM-2进行不同棉酚浓度的逐级驯化[17],菌株在YPD平板上的菌落较大且生长速度相对较快。随着培养基中棉酚含量增加,平板上的菌落逐渐变小,且生长速度明显减缓,这种现象很可能是因为菌株对高浓度的游离棉酚适应能力降低。

通过驯化产朊假丝酵母TM-2,即长期培育和选择,使其逐渐适应于含有不同浓度棉酚的生长环境,以提高发酵降解棉酚效果及发酵物的营养价值。将驯化前后的酵母活化后进行固态发酵,烘干粉碎后测定游离棉酚含量,结果如图4所示,相对于未驯化的TM-2,一级驯化后的菌株固态发酵效果不明显,棉酚含量还略微有所上升,而经过二级与三级驯化后,酵母TM-2适应了高浓度棉酚的生长环境,在固态发酵中也表现有所提升,游离棉酚由最初的147 mg/kg下降至132 mg/kg。因此,选择三级驯化的菌株即为我们的最终发酵菌株。

图4 产朊假丝酵母TM-2三级驯化后固态发酵棉粕的游离棉酚含量

2.5 驯化后产朊假丝酵母 TM-2的耐酸和耐胆盐性能

由图5a可知,产朊假丝酵母 TM-2在pH值为1的培养基中培养12 h,生存受到限制(p<0.05),耐受力仅为2.46%,菌株无法生长。随着pH值的升高,其存活率逐渐提高,当pH值3,培养12 h时,耐受力达到74.7%,表明产朊假丝酵母TM-2具有很好的耐酸性能。

图5 产朊假丝酵母TM-2耐酸性能和耐胆盐性能

小肠在正常状态下的胆盐质量浓度范围为0.3～3.0 g/L。产朊假丝酵母 TM-2对胆盐的耐受性能如图5b所示,当胆盐浓度较低时,其生长不受到明显抑制。然而,在胆盐浓度为2 g/L和3.5 g/L时,其生长有一定程度的下降。值得注意的是,在较高的胆盐浓度范围,即5～6.6 g/L条件下培养12 h,产朊假丝酵母TM-2的耐受能力仍然很强,其生长保持在90%以上,表现出优异的胆盐耐受能力。

2.6 驯化后的产朊假丝酵母TM-2在棉粕发酵上的应用

利用产朊假丝酵母TM-2对棉粕进行发酵,对发酵后的样品进行各项指标含量的测定,其结果如表1所示。发酵后,有害物质棉酚含量从578 mg/kg降低至128 mg/kg,棉酚含量的降低使得产品的安全性能得到提高。此外,产品气味略酸,pH值下降为5.43,粗蛋白占比由最初的46.5%提高到53.3%,酸溶蛋白也由最初的4.4%提高至12.4%。此外,在抗营养因子降解方面,棉籽糖和植酸的含量分别从8.9%和1.5%降低至0.8%和0.3%。综合表明,产朊假丝酵母 TM-2应用于棉粕固态发酵具有较好的解毒性能和提升营养价值的功效,能够显著改善饲料饲用品质,提高饲料的安全性[19]。

表1 产朊假丝酵母 TM-2发酵对棉粕品质的影响

3 结论

以0.3%棉酚为唯一碳源富集具有棉酚降解能力的菌株,初步分离获得81株酵母。通过其在棉酚液体培养基中的生长情况,筛选获得11株生长良好的菌株。将这11株菌株用棉粕固态发酵培养基进行发酵,并利用高效液相色谱进行定量分析,评估它们对棉酚的降解能力,获得1株游离棉酚降解率高达74.6%的菌株TM-2,结合纤维形态和ITS序列鉴定,鉴定其为产朊假丝酵母TM-2。产朊假丝酵母TM-2表现出了出色的益生性能,具有很好的耐酸和耐胆盐能力,将产朊假丝酵母TM-2应用于棉粕发酵中,发酵棉粕的游离棉酚从578 mg/kg降低至128 mg/kg,粗蛋白含量从46.5%提高到53.3%,酸溶蛋白含量也从4.4%提高至12.4%,蛋白品质得到有效提升,此外,抗营养因子棉籽糖含量从8.9%降低至0.8%。产朊假丝酵母TM-2可以显著改善棉粕的饲用品质。