紫葡萄皮中花青素提取工艺研究

张慧敏,何晓勇,刘平稳,孙玉田

1.郑州科技学院 食品科学与工程学院 (郑州 450064) 2.无锡中粮工程科技有限公司 (无锡 214035)

花青素是一种广泛存在于自然界中的多酚类化合物,具有强抗氧化和清除自由基的功能,而且抗肿瘤、抗衰老等食药价值极高[1]。葡萄中花青素主要集中在葡萄籽、皮中,从葡萄皮中提取花青素既可以提高葡萄皮的利用价值,又能更好的创造经济效益和社会效益[2]。目前,花青素的提取方法主要有酶法提取[3]、有机溶剂提取法[4]、微波提取法[5]、超声提取法[6]等。其中,有机溶剂提取法提取率较低且比较耗时,微波辅助提取法与酶法提取成本较高,且酶的活性受外界条件影响较大,而超声辅助提取相对成本低廉,操作简便[7]。因此本文以超声辅助的方式,采用单因素试验及响应面试验来确定料液比、超声时间、超声温度三个因素对葡萄皮中花青素的提取的影响,从而获得提取紫葡萄皮中花青素的最优工艺参数。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

巨峰葡萄,市购;原花青素,化学标准品,润友化学有限公司;甲醇、无水乙醇、盐酸、正丁醇、硫酸铁铵,均为分析纯,中国医药集团有限公司。

1.2 试验仪器

UV-4802型紫外可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;BS224S型分析天平,北京赛多利斯科学仪器有限公司;101-0ABs型真空干燥箱,上海科恒实业发展有限公司;TDL-50B型低速离心机,上海安亭科学仪器厂。

1.3 方法

1.3.1紫葡萄皮的预处理

挑选较好的葡萄,洗净后去掉果肉、籽,然后把葡萄皮均匀的平铺在铁盘上,放入烘箱内45 ℃烘24 h烘干,装进密封袋内避光保存,备用。

1.3.2花青素样品的提取

准确称取1.0 g葡萄皮于锥形瓶内加入20 mL的65%乙醇溶液,混合,在超声功率200 W下,30 ℃超声20 min。将超声处理后的样液倒入离心管内以3 000 r/min离心15 min,用移液枪取0.1 mL的上清液于10 mL的比色管内稀释,用甲醇定容至刻度线。移液管吸取1 mL的稀释液加入6 mL的正丁醇-盐酸溶液(95∶5)和0.2 mL的2%硫酸铁铵溶液,摇匀,放入烘箱100 ℃保温40 min,冷却15 min,用甲醇做空白对照,在546 nm的波长下测其吸光度[8]。

1.3.3标准曲线的绘制

称取原花青素标准品10 mg于甲醇中溶解,定容至10 mL的比色管内,用移液枪精确吸取0、0.10、0.25、0.50、1.00、1.50、2.00 mL移于10 mL的比色管内,用甲醇定容至刻度线,得到浓度为0、0.010、0.025、0.050、0.100、0.150、0.200 mg/mL的标准贮备液。取1 mL的标准液于10mL的比色管内,加入6 mL(95∶5)正丁醇-盐酸溶液0.2 mL 2%硫酸铁铵溶液,摇匀,放入烘箱100 ℃保温40 min,冷却15 min,在546 nm下测吸光度。以花青素浓度C为横坐标,吸光度A为纵坐标,绘制标准曲线。

1.3.4单因素试验

(1)不同料液比对葡萄皮中花青素得率影响

精确称取1.0 g葡萄皮于锥形瓶中,按1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL)料液比,分别加入65%乙醇溶液,按照1.3.2所述方法,研究不同料液比对葡萄皮花青素得率的影响。

(2)不同超声时间对葡萄皮中花青素得率影响

精确称取1.0 g葡萄皮于锥形瓶内加入20 mL的65%乙醇溶液混合,按照1.3.2所述方法,通过设置不同的超声时间,分别为20、30、40、50、60 min,研究不同超声时间对从葡萄皮中提取花青素的影响。

(3)不同超声温度对葡萄皮中花青素得率影响

精确称取1.0 g的葡萄皮于锥形瓶内加入20 mL的65%乙醇溶液混合,按照1.3.2所述方法,通过设置不同的超声温度,分别为30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃,研究不同的超声温度对葡萄皮中花青素提取的影响。

1.3.5响应面试验

根据单因素试验结果,选择对料液比、超声时间、超声温度为自变量,以Y紫葡萄皮花青素得率为响应值设计Box-Behnken工艺优化试验。响应面试验设计与水平见表1。

表1 响应面试验因素水平表

1.3.6葡萄皮中花青素含量计算

式中:C为稀释过的上清液中花青素的质量浓度,mg/mL;V为提取液的总体积,mL;N为稀释倍数;m为葡萄皮的质量,g。

1.3.7数据统计分析方法

试验过程中每次平行取样3次,对样品进行测定,通过Excel进行数据整理,使用Origin绘图。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

绘制标准曲线如图1所示。y=0.003 1x+0.751,R2=0.999。花青素质量浓度在0.000～0.200 mg/mL内的线性较好。

图1 花青素的标准曲线图

2.2 单因素试验结果

2.2.1不同料液比对花青素得率影响

由图2可知,当料液比(g/mL)在1∶10～1∶25时,随着料液比的增加,花青素得率也增大;当料液比(g/mL)为1∶25时,花青素得率最大,为21.17 mg/g;当料液比(g/mL)大于1∶25时,花青素得率降低,这可能是因为乙醇能让花青素与蛋白质、多糖结合的氢键断裂[9],使花青素提取量增加,当乙醇过高时,不利于提取液的浓缩,会对花青素的提取造成影响[1]。所以,葡萄皮花青素提取最适料液比(g/mL)为1∶25。

图2 不同料液比对花青素得率的影响

2.2.2不同超声时间对花青素得率影响

由图3可知,当超声时间在20～50 min时,随着超声时间的增加花青素的得率也增加;当超声时间达到50 min时,花青素得率最大,为33.8 mg/g;当超声时间大于50 min时,花青素得率降低。这可能是因为花青素与空气中的氧气接触而被氧化,使花青素得率下降。所以葡萄皮花青素提取最适超声时间为50 min。

图3 不同超声时间对葡萄皮中花青素得率的影响

2.2.2不同超声温度对花青素得率影响

由图4可知,当超声温度在30 ℃～50 ℃时,随着超声温度的上升花青素的得率呈上升趋势;当超声温度在50 ℃时,花青素得率最大,为22.50 mg/g;当超声波温度大于50 ℃时,花青素得率呈下降趋势。这可能是因为在一定的范围内适当的增加超声温度,能提高传质系数[10],降低溶剂粘度,有利于花青素的溶出,但是温度过高时,花青素也会被大量降解,影响花青素的得率。所以从葡萄皮中提取花青素的最适超声温度是50 ℃。

图4 不同超声温度对葡萄皮中花青素得率的影响

2.3 响应面试验结果分析

2.3.1响应面设计结果

根据单因素试验结果,料液比、超声时间、超声温度均为影响显著因素。利用DesignV8.0.6.1设计响应面试验,设计三因素三水平试验,确定A料液比、B超声时间、C、超声温度为自变量,以紫葡萄皮花青素得率为响应值Y,得到Y与A,B,C二次回归方程为:Y= -139.11+5.33A+1.42B+2.43C+0.004AB-0.002AC-0.008BC-0.105A2-0.012B2-0.020C2。试验设计最佳方案与结果见表3,方差分析结果见表4。

表3 葡萄皮中花青素响应面试验设计及结果

表4 响应面试验分析表

由表4可知,回归模型P值<0.000 1为极显著,失拟项P值为0.343 5>0.05则不显著,从而可知回归模型建立存在着可靠性。回归方程的决定系数R2为0.987 2,预测值与实际值拟合度较好,在统计学上是可信的,试验条件合适。由方差分析表可看出,一次项A及二次项A2、B2、C2对花青素得率的影响为极显著(P<0.01),交互项BC对花青素得率的影响显著(P<0.05),一次项B、C及交互项AB、AC对花青素得率的影响不显著(P>0.05)。

由F值可知,三因素对葡萄皮中花青素得率的影响顺序为:A料液比>B超声时间>C超声温度。

2.3.2交互响应面分析

三因素间交互影响的响应面图见图5～图7。当A料液比、B超声时间、C超声温度两两交互时,由图可以看出,三因素两两交互对花青素得率均有影响,各响应面之间存在差异。各图响应面变化形式均呈现为先上升后下降的状态,这表明各图都存在得率最大值点。

图5 料液比和超声时间交互间的响应面图

由图5～图7可以更加直观地了解各种响应因子对响应值的影响,每个响应面分别代表着两个独立变量之间的相互作用。三个因素与响应值之间呈现抛物线关系,各因素的增加带来的Y值的变化趋势不同。由图5、图6可知,随着A料液比的变化,得率出现一个较大曲面的弧度,其影响作用要大于B超声时间、C超声温度。这也验证了A料液比因素,是响应面分析中对响应值影响作用最显著的因子。由响应面试验得到葡萄皮中花青素提取工艺预测值为:料液比25.96 (g/mL),超声时间49.97 min,超声温度49.97 ℃,此时葡萄皮花青素的得率为25.67 mg/g。

图6 料液比和超声温度交互间的响应面图

图7 超声时间和超声温度交互间的响应面图

2.3.3响应面验证试验

为便于操作,将工艺条件调整为料液比(g/mL)1∶26、超声时间50 min,超声温度50 ℃,在此条件下进行试验,测出葡萄皮花青素得率的平均值为25.50 mg/g,验证试验值与优化预测值相符率高达99.3%,验证试验值与优化预测值之间良好的拟合性,进一步表明了模型的有效性。

3 结论

本文以紫葡萄皮为原料,采用65%乙醇超声波辅助法提取花青素,通过采用单因素试验和响应面试验,以花青素提取量为依据,对料液比、超声时间、超声温度三个影响因素进行测定,优化提取工艺。结果表明:花青素提取的最优工艺为料液比1∶26(g/mL)、超声时间50 min,超声温度50 ℃,在此最佳条件下葡萄皮花青素得率为25.50 mg/g。本研究可为超声波辅助有机溶剂从葡萄皮中提取花青素提供理论依据,且提取工艺简单、安全、无害。